黔东南州蓝莓叶部病害的种类调查和病原鉴定

张国辉，刘德波，宋盛英，杨芩，佀胜利

(1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011； 2.黔东南州森林植物检疫站，贵州 凯里 556000； 3.黔东南州林业局种苗与科技推广站，贵州 凯里 556000)

黔东南州蓝莓叶部病害的种类调查和病原鉴定

张国辉1，刘德波2，宋盛英3，杨芩1，佀胜利1

(1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011； 2.黔东南州森林植物检疫站，贵州 凯里 556000； 3.黔东南州林业局种苗与科技推广站，贵州 凯里 556000)

调查贵州省黔东南州台江县蓝莓Vaccniumuliginosum种植地发生的多种叶部病害，采用ITS保守序列测序和形态学鉴定的方法对致病病原微生物分类鉴定。结果表明蓝莓黑斑病、叶腐病、叶斑病和炭疽病的病原菌依次为互隔交链孢霉Alternariaalternata、大毛霉Mucormucedo、巨腔茎点霉Phomamacrostoma和胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

蓝莓；互隔交链孢霉；大毛霉；巨腔茎点霉；胶胞炭疽菌

蓝莓Vaccniumuliginosum又名越橘，属杜鹃花科 Ericaceae 越橘属Vaccinium植物。果实可直接食用，具有延缓脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等独特功效，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[1]。随着人们生活水平的提高，蓝莓以风味独特、营养保健功能强日益受到关注，在市场上供不应求，成为潜力巨大的经济林树种[2]。由于我国蓝莓产业化栽培时间较短，病害报道相对较少。目前，国内外报道的发生在蓝莓营养生长期间的重要叶部病原菌主要有Septoria，Anthracnose，Cylindrocladium和Exobasidium等[3]。国内现已做过研究报道的重要病原菌有灰霉病的致病菌灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.[4]、根癌病的致病菌根癌土壤杆菌Agrobacteriumtumefaciens[5]、炭疽病的致病菌尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum与胶孢炭疽菌C.gloeosporioides[6]和圆斑病的病原菌细极链格孢Alternariatenuissma[7]等。此外，僵果病的病原菌Moniliniavaccinii-corymbosi、锈病的病原菌Pucciniastrumvaccinii、白粉病的病原菌Microsphaeravaccinii[8]等虽有报道，但是没有进行详尽的病原鉴定及分析。在病害防治方面，蓝莓叶部病害在很多蓝莓种植基地有危害加重趋势，应引起重视。为减少病虫害的危害和充实贵州省黔东南州蓝莓病虫害科研资料，本文对贵州省黔东南州台江县蓝莓种植基地的叶部病害进行调查及病原真菌分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2014年8月在贵州省黔东南州台江县蓝莓种植基地进行病害调查，采集蓝莓病叶标本并记录病害发生的特点和症状；室内试验在凯里学院微生物实验室进行。

供试培养基为 PSA培养基；试剂有70%乙醇、0.1%升汞溶液和工业酒精。

1.2 试验方法

1.2.1 症状的观察和描述 观察并描述蓝莓发病部位的病斑颜色、形态、大小及危害程度等，并拍照。

1.2.2 病原菌的分离纯化和培养 采用组织分离法对蓝莓发病叶片进行病原分离，切取蓝莓病叶组织3块，接种在培养基上，再倒置于28 ℃培养2～3 d。对病原菌进行分离纯化，直至获得纯培养。再在显微镜下对病原菌进行镜检拍照，同时对致病菌的菌丝和孢子大小进行测量和记录。

1.2.3 病原鉴定 采用形态学鉴定和ITS保守序列测定对致病的病原微生物进行分类鉴定。ITS保守序列测定时，先将纯化后的病原菌在铺有玻璃纸的PSA培养基上培养4～5 d，刮取菌丝于灭菌研钵内研磨至粉状，DNA提取采用常规CTAB法。真菌ITSrDNA片段扩增使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应在ABI2720 PCR仪上进行，反应体系为25 μL。各组分如下：ddH2O 14.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物ITSI和ITS4各2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板 2.0 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；最后72℃ 10 min。反应结束后，取10.0 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统检测结果。将扩增产物利用凝胶回收试剂盒回收纯化后送北京诺塞基因组研究中心有限公司进行双向测序。根据测序结果，将菌株的ITS-rDNA序列与NCBI的GenBank数据库中已知序列进行序列比对与同源性分析，结合病原菌形态学鉴定结果，最终确定病原菌种类。

1.2.4 病原回接 纯化后的致病菌于PSA培养基上培养3～4 d，用无菌水洗下，配制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液，采用针刺法接种3片蓝莓健康叶片。发病后，再从病斑上分离病原菌并鉴定。

2 结果与分析

2.1 蓝莓黑斑病

症状 台江县蓝莓黑斑病侵染发病高峰期在4—5月，主要危害叶片。受害蓝莓的叶片大多都是从叶尖或叶缘发病，向中央部分扩展。发病部位褐色，发病严重时会影响蓝莓的生长发育(图1 a)。

形态鉴定 病原菌分生孢子梗褐色，具隔，顶端稍膨大，单生或丛生。分生孢子着生于分生孢子梗顶端，褐色，近椭圆形或倒棍棒形，壁砖状分隔，横隔膜1～4个，纵隔膜1～4个，分隔处略缢缩，顶端无喙状细胞，(3.5～8.5)μm×(1.5～4.0)μm。菌丝淡褐色，1～2μm(图1 b)。根据形态特征初步鉴定该病原菌为链孢霉Alternariasp。

菌株的ITS鉴定 利用通用引物ITS1和ITS4，通过PCR扩增得到522bp的ITS片段。对其进行测序后(见附件1)，在NCBI数据库中BLAST比对分析可知，该菌株的ITS片段与来源于大豆Glycinemax的AlternariaalternataF185 (Genebank NO.KM979936)相似性最高，为100%。

结合ITS的序列特征和形态学鉴定的结果，最终确定该病原菌为互隔交链孢霉Alternariaalternata。

a.初期症状；b.Alternaria alternata分生孢子图1 蓝莓黑斑病初期症状及其病原菌特征

2.2 蓝莓叶腐病

症状 该病主要危害叶片。叶尖或叶缘部位均可发病，引起叶部变色腐烂。发病部位褐色，叶缘发病部位往往出现皱缩变形，叶尖发病常出现深褐色软腐现象(图2 a)。

形态鉴定 病原菌菌落灰色，气生菌丝旺盛。病原菌的孢囊梗无色，无隔，不分支。顶端着生的孢子囊灰色，单生，表面有突起，圆形，直径60～90 μm(图2 b)。孢囊孢子无色，长椭圆形，大小为(15～20)μm×(7～10) μm。(图2 c)。根据形态特征鉴定该病原菌为大毛霉Mucormucedo。

2.3 蓝莓叶斑病

症状 蓝莓叶斑病主要危害叶尖。受害蓝莓的叶片大多都是从叶尖向中央扩展。发病部位褐色，发病严重时叶尖变褐皱缩死亡(图3 a)。

形态鉴定 病原菌分生孢子器黑色，散生、埋生或半埋生于培养基中，球型或近球形，顶端有孔，直径为70～150 μm。分生孢子椭圆形或卵形，无色，单胞，部分细胞中部有溢縮，大小为(4.0～6.0)μm×(1.5～2.0)μm,有1～2个油球(图3 b)。

图2 蓝莓叶腐病初期症状及其病原菌Mucor mucedo特征

a.发病症状；b.Phoma macrostoma的分生孢子器图3 蓝莓叶斑病症状及其病原菌特征

菌株的ITS鉴定 利用通用引物ITS1和ITS4，通过PCR扩增得到522bp的ITS片段。对其进行测序后(见附件2)，在NCBI数据库中BLAST比对分析可知，该菌株的ITS片段与来源于波叶大黄Rheumrhabarbarum的PhomamacrostomaWAC 7881(Genebank NO.DQ474117)相似性最高，为99%。

结合ITS的序列特征和形态学鉴定结果，最终确定该病原菌为巨腔茎点霉Phomamacrostoma。

2.4 蓝莓炭疽病

症状 该病主要危害叶片、枝条和果实。叶片沿叶尖及叶缘形成不规则形或椭圆形凹陷斑，病斑初为黄褐色，后扩展为深褐色，且中央灰褐色，其上散布有小黑点，交界线明显，棕红色(图4 a)。

形态鉴定 病原菌分生孢子无色，单胞，卵圆形或椭圆形，有2个油球，圆柱状，顶端钝圆，(9.5～27.0)μm×(3.5～7.0)μm(图4 b)。根据形态特征初步鉴定该病原菌为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

a.发病叶片症状；b.Colletotrichum gloeosporioides分生孢子图4 蓝莓炭疽病初期症状及其病原菌特征

菌株的ITS鉴定 利用通用引物ITS1和ITS4，通过PCR扩增得到560 bp的ITS片段。对其进行测序后(见附件3)，在NCBI数据库中BLAST比对分析可知，该菌株的ITS片段与来源于茶树Camelliasinensis的ColletotrichumgloeosporioidesCS32 (Genebank NO.KU145153)相似性最高，为99%。

结合ITS的序列特征和形态学鉴定结果，最终确定该病原菌为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

2.5 致病性测定 采用针刺法用孢子悬浮液接种3 d后，蓝莓叶片发病，发病率95%以上。再从病斑上采用组织分离法分离病原菌并鉴定，结果表明分离菌株与以上接种菌株相同，根据柯赫氏法则，证明接种菌株为蓝莓叶部病害的致病菌。即蓝莓黑斑病、叶腐病、叶斑病和炭疽病的病原菌分别为互隔交链孢霉、大毛霉、巨腔茎点霉和胶胞炭疽菌。

3 结论与讨论

本文研究结果表明黔东南州叶部病害蓝莓黑斑病、叶腐病、叶斑病和炭疽病的病原菌分别为互隔交链孢霉、大毛霉、巨腔茎点霉和胶胞炭疽菌。

蓝莓叶部病害的鉴定各地结果并不一致。云南省引起蓝莓叶斑病的病原菌鉴定为细极链格孢菌Alternariatenuissima，该菌不但可以侵染蓝莓叶部引起叶斑病，同时也侵染蓝莓嫩枝和果实[8]。辽宁省对蓝莓炭疽病发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定，基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致[6]。吉林省的研究表明是由石楠拟盘多毛孢Pestalotiopsisphotiniae引起的蓝莓圆斑病[3]。本文研究的结果为贵州省蓝莓叶部病害的鉴定提供了科学依据。

鉴于蓝莓叶部病害的症状相似性很高，为确保蓝莓病害鉴定的可靠性，必须加大室内分离纯化鉴定的工作量，纠正以病害特征为主的鉴定方法。要保证蓝莓生产走有机方向，就必须提前预防和综合防治病害。在病害预防方面，应采用抗病虫品种、培育壮苗、加强栽培管理、清洁田园等一系列措施[5]。在蓝莓叶部病害的防治方面，主要有以下措施可行：越冬前清除果园落叶，结合修剪剪除带病枝条集中处理[7]。同时，在国外蓝莓品种引进方面要加强苗木的检疫检验，防止带病菌植株流入国内[9]；筛选高效菌根真菌和制备菌根制剂对蓝莓的生产也有深远的影响[10]。

志谢：感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所范成明副研究员和中国科学院微生物研究所王龙老师提供的病原菌分子鉴定结果。

附件1:

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附件2:

TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTGTAGGCTTTGCCTGCTATCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTCGTTTCCTCGGCGGGTCCGCCCGCCGATTGGACAATTTAAACCCTTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTTTGCGCGCAGACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCACTCTGCCTTCAGAACGACGGCGTCCAGAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCTCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA

附件3:

TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCTGTTTGTGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA

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SpeciesinvestigationandpathogenidentificationofblueberryleafdiseasesinsoutheastGuizhou/

ZHANG Guohui，et al.

( Department of Environment & Biological Sciences,Kaili College,Kaili Guizhou 556011,China)

The leaf diseases ofVaccniumuliginosumplanted in Taijiang county of Guizhou province were investigated.The pathogenic fungi were identified by ITS conserved sequence and morphological method.The results showed that the pathogen wereAlternariaalternata,Mucormucedo,Phomamac-rostomaandColletotrichumgloeosporioides.Those pathogenic fungi respectively lead to black spot disease,leaf mould,leaf blight and anthracnose.

Vaccniumuliginosum;Alternariaalternata;Mucormucedo;Phomamacrostoma;Colletotrichumgloeosporioides

2016-04-26

贵州省普通高等学校创新团队(黔教合人才团队字[2014]48)；贵州省教育厅“125 计划”重大科技专项项目(黔教合重大专项字[2013]028)

张国辉(1978—)，女，辽宁东港人，硕士，副教授，主要从事植物病理教学和研究，E-mail：59833259@qq.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0042-05

(责任编辑 杨静莉)