昆明市山茶炭疽病菌生物学特性研究

韩长志，赵惠谊

(西南林业大学林学院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

昆明市山茶炭疽病菌生物学特性研究

韩长志，赵惠谊

(西南林业大学林学院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

对山茶炭疽病菌Gloeosporiumtheae-sinensisMiyaka生物学特性进行研究。该病菌最适生长条件为PDA、28 ℃、pH7；能在多种碳源和氮源条件下生长，碳源以可溶性淀粉最适，氮源以蛋白胨最适。

茶炭疽盘长孢菌；山茶炭疽病；生物学特性；昆明市

炭疽病是山茶CamelliajaponicaL.上最常见和发生最为严重的病害之一，不仅为害其幼嫩叶片和枝梢，而且还可以危害老叶，受害植株出现落叶、落蕾、落花以及枝条枯死等现象，严重降低了山茶的观赏价值。云南山茶原产云南，作为昆明市的市花，具有较高的观赏价值。2014年7—8月，调查昆明市昙华寺公园内植物病害的发生情况，发现山茶炭疽病的发病率高达96.8%、病情指数为30.20，对其病原菌分离鉴定，确定是由茶炭疽盘长孢Gloeosporiumtheae-sinensisT.Miyake引起[1]。学术界多从发病因素[2-3]、防治方法[4-5]等方面开展山茶炭疽病的研究，也有学者对采自浙江金华职业技术学院引起该病的病原菌进行了生物学特性研究[6]。鉴于炭疽病菌在不同地区具有小种分化等特性[7]，有必要对引起云南山茶炭疽病的病菌开展生物学特性研究，因此，作者对前期所获得的山茶炭疽病菌的生物学特性进行试验，以期为进一步开展该病菌遗传关系以及防治该病提供重要的理论支撑。

1 材料和方法

1.1 菌种 山茶炭疽病菌(茶炭疽盘长孢)分离于昆明市昙花寺公园的山茶叶片，将获得的纯培养菌株保存在试管斜面，4 ℃冰箱中保存。菌种保藏于云南省森林灾害预警与控制重点实验室，菌种编号SCCG-1。

1.2 病原菌生物学特性研究 生物学特性的研究选择常规培养基PDA进行病菌培养。即，用直径7 mm的打孔器将PDA培养基上培养7 d(28 ℃恒温培养箱、黑暗条件)的病原菌菌落打成菌丝块接种PDA培养基上(不同的培养基、碳源和氮源测试分别见1.2.1，1.2.5，1.2.6)，28 ℃恒温培养(不同温度测试除外)，每种处理5个重复，培养5 d。观察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法测量菌落直径，统计分析病原菌生长差异。

1.2.1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响 选择5种培养基做比较。

①马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；②马铃薯蔗糖培养基(PSA)：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；③燕麦培养基(OA)：燕麦片30 g、琼脂粉20 g、水1000 mL；④清水洋菜培养基(WA)：琼脂粉20 g、水1000 mL；⑤玉米粉培养基(CMA)：玉米粉40 g、蔗糖10 g、琼脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 将病原菌分别置于5，11，20，25，28，37 ℃的恒温培养箱中培养。

1.2.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 在无菌条件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的盐酸溶液调节灭菌的PDA培养基pH值，设pH值为3，4，5，6，7，8，9，10，11等9个梯度。

1.2.4 不同密封条件对病原菌菌丝生长的影响 采用培养皿Parafilm胶带封口和不封口两种方法。

1.2.5 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏培养基为基础，以不加碳源为对照，用含有相当量碳的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多种碳源代替查氏培养基中蔗糖，做成不同碳源的固体培养基。

1.2.6 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏培养基为基础，以不加氮源为对照，用含有相当量氮的硝酸铵、磷酸二氢铵、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多种氮源代替查氏培养基中的硝酸钠，做成不同氮源的固体培养基。

1.3 数据统计与分析 用Excel 2007对原始数据进行分析、处理和作图。所有图形中的正负偏差均表示标准误(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)计算。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响 山茶炭疽病菌在PDA上生长速度最快，且菌丝最密集；其次为PSA、CMA、WA以及OA(表1、图1)。

表1 不同培养基对山茶炭疽病菌菌丝生长的影响

注：“+”一般；“++”密；“+++”较密；“++++”紧密。

图1 不同培养基上病原菌生长对比

2.2 不同温度对病原菌生长的影响 在20，25，28 ℃条件下，山茶炭疽病菌能正常生长，以28 ℃时菌丝生长速率最大(图2)，而在5，11，37 ℃条件下，病原菌不能生长。将此3种温度下培养的病原菌转移至28 ℃条件下继续培养后，菌丝又能恢复生长，该现象表明山茶炭疽病菌可以暂时忍受5，11 ℃的低温以及37 ℃的高温，待外界环境条件恢复后依然可以正常生长。

2.3 不同pH对病原菌菌丝生长的影响 以PDA为基础培养基，pH3条件下山茶炭疽病菌不能生长，pH4～10时病原菌均能生长，尤以pH为7时菌丝生长速率最大，其次为pH 6，8(图3)。

图2 不同温度对病原菌生长速率的影响

图3 不同pH培养基上病原菌生长速率

2.4 不同密封条件对病原菌的生长影响 使用parafilm封口膜对培养皿封口条件下，山茶炭疽病菌的生长较不封口好、生长速度更快，平均生长速率为10.44 mm/d。这个结果表明，不通气条件更加适宜山茶炭疽病菌的生长。

2.5 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 山茶炭疽病菌在6种供试碳源的培养基上均能快速生长，尤以可溶性淀粉作为碳源的条件下生长最快，其次是葡萄糖；值得关注的是，在不加碳源的对照培养基上，尽管该菌菌丝生长速率与添加乳糖、果糖等碳源的培养基的生长速率差别不大，但其所形成的菌落较为稀疏、菌丝颜色较浅(图4)。

图4 不同碳源对病原菌生长速率的影响

2.6 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 山茶炭疽病菌在不同的氮源培养基上生长速率不尽相同，在6种所供试的氮源培养基上，蛋白胨作为氮源的培养基上病原菌生长最快，且菌丝白色、密集，菌落较厚；其次是甘氨酸和酵母膏；硫酸铵和磷酸二氢铵作为氮源不适宜该病原菌生长，出现抑制生长现象(图5)。与缺乏碳源相似，病原菌在缺乏氮源的培养基上所形成的菌落稀疏，颜色也较浅。

3 结论与讨论

本研究从不同培养基、温度、pH、密封情况、碳源以及氮源等方面对山茶炭疽病菌的菌丝生长影响进行了研究，明确该病原菌生长适宜温度为28 ℃，温度低至5 ℃或达到37 ℃时不能生长；最适pH为7，适合较宽的酸碱度范围；密封有利于该病原菌生长；能在多种碳源和氮源情况下生长，碳源以可溶性淀粉最适，氮源以蛋白胨最适。该结果除温度与前人研究结果较相似外[6]，其他指标均具有较大的差异性，即菌丝生长的最适温度为25～30 ℃，最适pH为5～6，最适碳源则为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖。

图5 不同氮源对病原菌生长速率的影响

上述研究结果为进一步开展山茶炭疽病菌的致病基因功能研究提供了重要的培养条件，也为该病菌可危害多种植物提供了重要的理论解释。尽管如此，尚缺乏开展上述不同条件对山茶炭疽病菌孢子的影响情况分析，有待于今后进一步开展相关研究。

[1] 韩长志，赵惠谊.昆明市山茶炭疽病病原菌鉴定初报[J].中国森林病虫，2016，35(5)：5-6.

[2] 何美仙,罗军,贾春蕾,等.山茶炭疽病发病的影响因素研究[J].林业实用技术，2006(12):22-23.

[3] 何美仙，罗军，贾春蕾，等.山茶炭疽病发病因素的研究[J].安徽农学通报，2006(10):137-138.

[4] 李景蕻.山茶炭疽病的发生和防治[J].农村实用技术，2004,(1):21.

[5] 赵东,徐进才.山茶炭疽病发生及防治技术[J].安徽农业，2003(6):24.

[6] 何美仙.山茶炭疽病菌生物学特性研究[J].浙江农业科学，2005(4):316-318.

[7] 韩长志.炭疽菌属真菌分类研究现状及发展趋势[J].中国植保导刊，2015(6):24-30.

BiologicalcharacteristicsofthepathogenofGloeosporiumtheae-sinensisinCamelliajaponica/

HAN Changzhi,et al.

(Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province;College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

The biological characteristics ofGloeosporiumtheae-sinensis，the pathogen of camellia anthracnose were studied.The results showed that the optimal conditions for the growth of the pathogen was PDA media,28 ℃,pH 7,with carbon source as soluble starch,nitrogen source as peptone.

Gloeosporiumtheae-sinensis;camellia anthracnose;biological characteristics;Kunming city

2015-10-27

国家自然科学基金项目(31560211)，云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目(50097505)，云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队(2014015)，云南省森林灾害预警与控制重点实验室开放基金项目(ZK150004)，云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y330)

韩长志(1981—)，男，博士，讲师，河北省石家庄人，从事经济林木病害生物防治与真菌分子生物学的科研工作，E-mail:hanchangzhi2010@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0026-03

(责任编辑 杨静莉)