年龄、部位对新疆驴皮中型胶原蛋白表达影响的研究

王艳萍 ，高 帅 ，刘 迥 ，梁 巩 ，张 媛 ，曾维斌 *

（1. 石河子大学动物科学学院，新疆石河子 832003；2. 塔里木大学动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300；3.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

王艳萍1,2，高 帅3，刘 迥1，梁 巩1，张 媛1，曾维斌1,2*

（1. 石河子大学动物科学学院，新疆石河子 832003；2. 塔里木大学动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300；3.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

本研究旨在探究不同年龄、不同部位新疆驴皮中?型胶原蛋白2个亚基基因（COL1A1、COL1A2）mRNA的表达量及其蛋白含量的差异，确定宰驴取皮的年龄段，以提高驴皮的利用率。对不同年龄段新疆驴背部皮肤组织，应用RT-qPCR、Western blotting技术检测胶原蛋白基因的表达量及其蛋白含量；对新疆驴不同部位皮肤进行HE染色切片与RT-qPCR技术分析。结果表明：6～7岁年龄段的驴皮中COL1A1、COL1A2基因的表达量及其蛋白含量显著高于其他各年龄段（P<0.05）。从组织切片上可以看到，驴皮背部与颈部的胶原纤维密集且多，而脸部的疏松且少，腿部和腹部居中；这与其胶原蛋白基因RT-qPCR的结果相一致。综上，6～7岁年龄段的新疆驴背部皮肤中，胶原蛋白基因的表达量及含量最高，故此年龄段可作为宰驴取皮的最佳年龄段。

驴皮；胶原蛋白；基因

驴皮是生产阿胶的唯一原料。驴真皮中的主要蛋白质是?型胶原蛋白，它是由2条相同的α1链（由COL1A1基因表达）和1条α2链（由COL1A2基因表达）组成的异质胶原，它和血清白蛋白等多肽类物质、多糖类物质及其他小分子物质构成了阿胶的主要成分[1]。

皮肤胶原蛋白及透明质酸是由真皮层内的成纤维细胞合成的，随着皮肤组织与真皮成纤维细胞的不可避免性衰老，胶原蛋白的表达量将逐渐降低[2]。TGF-β1/Smad信号通路调节真皮成纤维细胞?、IV型胶原蛋白的表达量，此通路上正向调控胶原蛋白表达的基因也随着年龄的增加其表达量呈显著降低趋势[3]。50～70年龄段女性乳腺皮肤中，IV型胶原蛋白的表达量较30～50年龄段的降低63%[4]。从死亡24 h内、平均年龄23.3岁的成年男性尸体腹部肌肉样品中，检测到?、IV型胶原蛋白的含量及密度都显著高于平均年龄为46.2岁的[5]。RT-qPCR技术检测来自不同年龄鼠尾部皮肤原代成纤维细胞中基因的表达量，发现青年组成纤维细胞中COLl、COL3基因mRNA的表达量显著高于老年组[6]。

在生产实践中，青年驴因皮肤薄而熬制的阿胶较少；老年驴相对皮厚，能得到较高重量的阿胶，但年龄太老，会导致驴皮中的胶原蛋白含量因老龄而大量流失，且养殖的时间越长，饲养成本则相应提高。在集约化养殖业中，具体在哪个年龄段“宰驴取皮”才能得到最高的胶原蛋白，目前仅凭借养殖经验来估计，故本研究拟通过分子生物学的技术，检测不同年龄段、不同部位驴皮中胶原蛋白的含量，为现代化生产中“宰驴取皮”的最佳年龄段的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 皮肤样本的采集 本研究所用新疆驴皮肤组织采自于阿克苏肉驴屠宰场，通过驴的齿龄和初生记录，选定体重一致、体况良好的0～1、2～3、4～5、6～7、8～9、10～11、12～13岁年龄段的新疆驴各5只，屠宰前刮去需采样部位的被毛，现场屠宰后，迅速采集驴皮组织样，并立即置于液氮中，然后保存于-80℃冰箱，用于总RNA与蛋白的提取。另外，将其中一部分6～7岁驴背、腹、颈、腿（后肢小腿）、面部皮肤组织样置于10%甲醛溶液中用于组织切片的制作。

1.2 主要试剂 Trizol和Ranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit均 购 于Life Technologies公 司；LightCycler 480 SYBR Green I Master购于Roche公司；蛋白裂解液为RIPA裂解液（中），购于康为世纪；琼脂糖购于Thermo scientific公司；?型胶原蛋白一抗为Anti-Collagen I抗体（货号ab34710）购于abcam公司，内参Gapdh的一抗为Anti-Gapdh抗体（货号G9545）购于Sigma公司。二抗均为羊抗兔，购于中杉金桥公司。

1.3 试验方法

1.3.1 RT-qPCR技术检测 胶原蛋白COL1A1、COL1A2基因mRNA的表达量总RNA的提取：采用TRIzol（异硫氰酸胍）-酚-氯仿一步抽提法按试剂盒说明书提取总RNA，经紫外分光光度计检测 OD260/OD280>1.9。

反转录cDNA： cDNA 第 1 链的合成，使用20 μL体系，主要包括反应缓冲液、10 mmol/L dNTP、1 μg 总 RNA（0.1 μg RNA）、50 U RNase inhibitor、50 U AMV 反转录酶、1.6 μg oligo（dT）15；此体系于42℃反应30 min，99℃ 5 min 终止反应，最终反转录出cDNA。

引物设计及荧光定量PCR: 根据NCBI中公布的COL1A1、COL1A2基因mRNA的序列，采用Primer 5.0软件设计1对引物，并交invitrogen公司北京合成部合成。建立 100 μL的反应体系，用荧光定量试剂盒，定量PCR检测?型胶原蛋白COL1A1、COL1A2基 因mRNA的 表 达 量。实验中使用Gapdh作为内参基因。驴皮胶原蛋白COL1A1、COL1A2基因引物序列见表1。

1.3.2 胶原蛋白的Western blot表达量检测 将蛋白裂解液加入到真皮组织中，冰上孵育30 min后，离心提取蛋白上清，经Bradford assay法检测蛋白浓度。将蛋白样品等量(约30 μg)加样按照常规步骤进行SDS-PAGE电泳，电转膜，封闭，抗体孵育和发光检测。一抗稀释浓度分别为胶原蛋白?(1:500)，Gapdh (1:3000)；二抗为羊抗兔（1:5000）；蛋白条带经软件Quantity One定量分析。

1.3.3 驴皮组织切片制作 驴皮肤组织用10%甲醛固定，石蜡包埋。切片厚度为7 μm。展片水温40℃，烤片温度为55℃，烤片3 h。应用常规HE染色法染色，其过程包括脱蜡、脱水、染色、分化、促蓝、透明等过程，染色后再进行脱水与封片。

1.4 统计分析 应用11.5版SPSS软件的单因素方差分析对数据进行统计学处理，所有试验至少重复3次，数据用平均数±标准差进行表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 不同年龄驴背部皮肤中COL1A1、COL1A2基因mRNA的水平变化 不同年龄驴背部皮肤中胶原蛋白的表达量完全不同（表2），6～7岁驴背部皮肤中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表达水平显著高于其他年龄段（P<0.05），其次为4～5岁年龄段胶原蛋白的表达量，其余年龄段的表达量都比较低，尤其在驴9岁以后，COL1A2基因的mRNA几乎不表达。比较两个基因的表达量可见，驴各年龄段COL1A1基因的mRNA表达水平远高于COL1A2基因的表达量（P<0.05）。

2.2 不同年龄段驴背部皮肤中胶原蛋白的含量变化不同年龄驴背部皮肤中I型胶原蛋白的含量完全不同（图1），与胶原蛋白的组成基因表达量相一致（表2），6～7岁驴背部皮肤中胶原蛋白的含量显著高于其他年龄段的（P<0.05），其次是4～5年龄段胶原蛋白的含量，其余年龄段的含量都比较低。

表1 COL1A1、COL1A2基因的引物序列

表2 不同年龄段驴皮中COL1A1、COL1A2基因mRNA的相对表达水平变化

图1 不同年龄段驴皮中胶原蛋白的含量

2.3 6～7岁不同部位驴皮肤组织结构特点 在低倍（4×10）显微镜下观察到，驴的皮肤从外向内由表皮和真皮组成，表皮比较薄，由复层扁平上皮构成（图2）。真皮比较厚，由大量的胶原纤维和少量的弹性纤维、网状纤维及细胞组成。驴皮肤真皮层中，胶原纤维HE染色呈现粉红色，且排列密度随部位不同呈现一定的差异。背部和颈部胶原纤维纵横交错，排列细密且含量多，其次是腿部和腹部，胶原纤维排列比较疏松，脸部皮肤胶原纤维含量最少。

图2 驴背部、腹部、颈部、腿部和脸部皮肤组织的HE染色

2.4 6～7岁驴不同部位驴皮中COL1A1、COL1A2基因RT-qPCR结果 6～7岁驴不同部位驴皮中胶原蛋白的表达量不同（表3），颈部和背部皮肤中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表达水平显著高于脸部的（P<0.05），腹部和腿部胶原蛋白的表达量居中，各部位皮肤中，COL1A1基因的mRNA表达水平远高于（P<0.05）COL1A2基因的表达量。

表3 不同部位驴皮中COL1A1、COL1A2基因mRNA的相对表达水平变化

3 讨 论

胶原作为一种结构蛋白，是人体皮肤的主要成分，胶原蛋白形成皮肤支架，使皮肤具有弹性、光泽，而富含胶原蛋白的组织很容易表现出一些与年龄相关的生理变化，随着人的衰老，成纤维细胞数量减少，则胶原蛋白分泌减少，造成皮肤中层萎缩，即出现鱼尾纹、额头纹、鼻唇沟变深等现象，因此胶原蛋白一直被当作探讨衰老机制的一个重要指标[7]。检测不同年龄组女性单位面积皮肤胶原量的变化表明，幼年和青少年时期皮肤较薄，含水量较多，单位面积皮肤的胶原量相对较少，30 岁以后，由于真皮成纤维细胞数量逐渐减少，活力下降，胶原分泌也减少[8]。人到老年时，皮肤中的?型胶原蛋白会大量流失，皮肤将变的薄且脆弱，受伤后愈合迟缓，10～64 岁年龄段女性皮肤成纤维细胞内，胶原蛋白的表达量与年龄呈显著相关性[9]。

动物在进入老年皮肤中胶原蛋白流失之前，由于胶原蛋白是真皮的主要组织成分，其皮肤的厚度和胶原蛋白的含量呈正相关性[10]，不同动物的真皮厚度各异，牦牛皮颈部最厚，厚度达到 9.24 mm，臀部次之，腹部最薄，厚度仅为 4.50 mm，颈部的厚度是腹部的2倍[11]。澳大利亚美利奴绵羊真皮层以臀部最厚，颈部次之，腹部最薄，臀部与腹部厚度之比约为 1.6:1[12]，而关于驴真皮中的胶原蛋白表达及厚度等情况还未见报道。

本研究发现，驴皮中的胶原蛋白的表达量及总含量随年龄不同而异，在6～7 岁驴背部皮肤中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表达水平显著高于其他年龄段的（P<0.05），而且其背部、颈部皮肤中胶原蛋白的表达量和组织切片的结果显示其含量最高，且显著高于面部的（P<0.05），这与其他家畜各部位的厚度情况基本一致，在生产实践中，制作高品质阿胶时，驴腿部和面部的皮肤作为下脚料应被弃用。

4 结 论

6～7岁年龄段的新疆驴皮肤中，胶原蛋白的COL1A1、COL1A2基因mRNA的表达量和其含量都最高，故此年龄段为“宰驴取皮”的最佳时期。

[1]Cheng X L, Wei F, Xiao X Y,et al. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/timeof-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis [J]. J Pharm Biomed Anal,2012, 62: 191-195.

[2]Kremer A, Ribitsch I, Reboredo J,et al. Three-Dimensional Coculture of Meniscal Cells and Mesenchymal Stem Cells in Collagen Type I Hydrogel on a Small Intestinal Matrix-A Pilot Study Toward Equine Meniscus Tissue Engineering[J]. Tissue Engineering Part A, 2017, 5: 390- 402.

[3]Silbiger S, Lei J, Ziyadeh F N,et al. TGF-beta1-stimulated type IV collagen gene transcription in murine mesangial cells [J]. Am J Physiol, 1998, 274: 1113-1118.

[4]F J, D E, R L,et al. Aging decreases collagen IV expression in vivo in the dermo-epidermal junction and in vitro in dermal fi broblasts: possible involvement of TGF-β1[J]. Eur J Dermatol, 2016, 26(4): 350-360.

[5]Calvi E N C, Nahas F X, Barbosa M V ,et al. Collagen fibers in the rectus abdominis muscle of cadavers of different age [J]. Hernia, 2014, 18: 527-533.

[6]宋仁刚. ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮肤成纤维细胞中的表达及意义[J]. 组织工程与重建外科杂志, 2012, 8(5):264-266.

[7]Larson B J, Longaker M T, Lorenz H P. Scarless fetal wound healing: A basic science review[J]. Plast Reconstr Surg,2010, 126: 1172-1180.

[8]Sudel K M, Venzke K, Mielke H,et a1. Novel aspects of intrinsic and extrinsic aging of human skin:beneficial effects of soy extract[J]. Photoehem Photobiol, 2005, 8l(3):581-587.

[9]Quan T H, Shao Y, He T. Reduced Expression of Connective Tissue GrowthFactor (CTGF/CCN2) Mediates Collagen Loss in Chronologically Aged Human Skin[J]. J Invest Dermatol, 2010, 130: 415-424.

[10]Dang Y, Liu B, Liu L,et al. The 800-nm diode laser irradiation induces skin collagen synthesis by stimulating TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Lasers Med Sci, 2011,26: 837-843.

[11]左秋, 陈武勇, 张涛, 等. 基于裘皮制作的西藏牦牛皮组织结构研究[J]. 皮革科学与工程, 2010, 20(3): 14-18.

[12]陈敏, 程海明, 孙丹红, 等. 澳大利亚美利奴绵羊皮组织结构观察[J]. 皮革科学与工程, 2002, 12(6): 11-14.

S822.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-041

2017-04-21；

2017-06-13

国家自然科学基金项目（31360530、31260531）；兵团塔里木畜牧科技重点实验室项目（HS201503）

王艳萍（1978-），女，甘肃渭源人，硕士，副教授，主要从事基础兽医学和动物生殖技术的研究，E-mail：wypdky@126.com

*通讯作者：曾维斌，副教授，主要从事动物繁殖与生物技术的研究，E-mail：zwbdky@126.com