伊犁马GHR基因多态性及其与泌乳性能的关联分析

孟 吉吉,于农淇，高 源，邬明丽，樊英智，雷初朝，刘武军，党瑞华*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

伊犁马GHR基因多态性及其与泌乳性能的关联分析

孟 吉吉1,于农淇1，高 源1，邬明丽1，樊英智1，雷初朝1，刘武军2，党瑞华1*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

马奶具有较高的营养价值，但目前关于马泌乳性能方面的研究很少。本实验对伊犁马生长激素受体（GHR）基因外显子和启动子设计13对引物，以DNA混合池为模板，采用PCR-RFLP法检测188匹伊犁马GHR基因多态基因型，并分析有产奶量记录的73匹伊犁马GHR基因多态性与泌乳性状之间的关系。结果表明：在伊犁马中检测到GHR基因启动子T-562C突变，CC、TC、TT 3种基因型，其基因型频率分别0.309、0.676、0.016；C为优势等位基因，频率为0.646，T基因频率为0.354；虽然各基因型间产奶量并没有显著差异（P>0.05），但各基因型的产奶量依次为TT>CC>TC，基因C突变为T可使产奶量有上升趋势，研究结果可为我国乳用马的选育提供一定的参考。

伊犁马；生长激素受体基因；泌乳性能；多态性

生长激素（GH）是一种由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单一肽链蛋白质类激素[1]，本身不能直接穿过细胞膜，必须通过与靶细胞膜表面上的生长激素受体结合，通过介导将信息传递到细胞内才能发挥生理学功能[2]。生长激素受体（GHR）基因结构复杂，其遗传变异意义重大，很容易造成下游基因表达水平的变化，进而引起生理功能的变化[3]。垂体-GH-GHR轴是泌乳性状调控的主要机制之一，此过程相关基因也很可能参与泌乳等性状的调控。

GHR基因在马21号染色体上，有10个外显子。Rahmatalla等[4]研究发现，荷斯坦牛GHR基因在第836位发生T/A突变，产奶量显著增加；Blott等[5]的研究也证明了这一观点。王凯等[6]研究结果表明，南方荷斯坦奶牛基因多态性对乳蛋白率有显著影响，但对产奶量影响不显著，邱峥艳等[7]的研究也证明了这一点。还有许多研究表明，GHR可能是影响泌乳性状的候选基因。

马奶具有很高的营养价值，与人乳相近，并且易消化吸收[8]。我国地方品种马产奶量较低，且不能稳定遗传。目前，畜禽育种已进入分子选育时代，但关于马泌乳性能的分子标记研究少有报道。本研究采用DNA混合池、PCR-RFLP等技术对伊犁马GHR基因进行多态检测并揭示其是否与产奶量相关。这也是首次对伊犁马GHR基因进行相关研究，对我国马奶产业的发展有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物 在新疆伊犁昭苏马场选择188匹母马为研究对象。选取年龄约为5～6岁、胎次3～4胎，放牧、饲养和管理条件相同的73匹伊犁马，记录其日产奶量。

1.2 引物设计与合成 根据马GHR基因的相关序列（GenBank号：NC_009164），利用NCBI Primer Designing Tool 设计13对引物，扩增伊犁马GHR基因目的序列，引物送上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

1.3 血样采集 对188匹伊犁马成年母马采用枸橼酸钠抗凝管对其进行颈静脉采血，装于真空采血管中，于-20℃保存备用。

1.4 基因组DNA的提取 采用酚-氯仿法提取血液中的基因组DNA，并用1%琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度，-20℃冷冻保存。

1.5 DNA池PCR扩增 利用构建的DNA池进行PCR 反应。PCR 反应体系为 12.5 μL：Mix 6.25 μL，上游和下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。

PCR反应条件：95℃预变性4 min，95℃变性30 s；退火45 s（退火温度见表1）。72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸10 min；4℃保存备用。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。

1.6 直接测序及BLAST检测 选取条带分明、无杂带、产量高的PCR产物送西安擎科有限公司测序。测序完成后利用SeqMan程序校正测序结果并分析有无 SNPs。

1.7 PCR-RFLP分析 根据基因序列，选用限制酶HinfI来进行酶切分型，酶切反应体系为15 μL，包括 PCR 产物 5 μL，ddH2O 8.7 μL，限制酶 0.3 μL，限制酶缓冲液1 μL，在37℃恒温条件下酶切10 h。

1.8 统计分析 整理汇总酶切分型结果，进行基因频率计算，根据结果进行Hardy—Weinberg平衡适合性检验并计算多态信息含量（PIC）、杂合度和有效等位基因数（Ne），并用SPSS20.0软件进行产奶量与基因型的关联分析。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测结果 使用1%琼脂糖凝胶电泳扩增出的PCR产物特异性强、产量高、无拖尾现象（如图1），可以送样测序并用于RFLP检测。

表1 伊犁马GHR基因引物序列及扩增区域

图1 GHR基因引物扩增结果

2.2 PCR产物序列分析 选取特异性强、产量高的PCR产物送西安擎科公司进行测序，并对测序结果用DNAStar软件的SeqMan程序进行分析。分析发现，在GHR基因外显子上没有发现突变，而在启动子区上检测到了1个SNP位点（T-562C）（图2）。

图2 GHR基因SNP测序检测结果

2.3 PCR-RFLP分型 分析结果表明（图3），在伊犁马GHR基因启动子第-562 bp处检测到2种等位基因C和T，3种基因型，分别命名为CC、CT和TT。

对不同基因型个体的PCR产物测序后结果表明，CC型基因序列与GenBank（GenBank号：NC_009164）上一致，将其定义为野生型，而TT型定义为突变型。

图3 GHR基因扩增产物酶切分型

2.4GHR基因启动子的群体遗传结构分析 进行遗传参数的SNPs位点统计（表2），3种基因型的分布表现为TC>CC>TT，其频率分别为0.676、0.309、0.016，C为优势等位基因频率为0.646，T基因频率为0.354。对其进行卡方适合性检验后发现该基因不处于哈代-温伯格平衡状态，可能由于样本量太少所致。另外，其多态信息含量（PIC）为0.352 7，属于中度多态。杂合度为0.457，纯合度为0.543，有效等位基因数（Ne）为1.842 3。

2.5GHR基因启动子多态性与产奶量关联分析 对73只伊犁马的产奶量按不同基因型两两比较进行t检验，结果表明T-562C位点各种基因型之间差异不显著（P>0.05），但等位基因C突变为T后产奶量有上升的趋势（表3）。

表3 伊犁马GHR不同基因型与日平均产奶量的关联分析

3 讨 论

本研究以 188头伊犁马为实验样本，对GHR基因进行了多态调查，在启动子区发现多态，群体遗传学分析显示此位点处于哈代-温伯格平衡、中度多态（0.25＜PIC＜0.5）。此突变位点存在3种基因型，且碱基T对C的替换对产奶量有一定的提升作用，这可能是由于该突变影响了GHR基因的转录。群体不处于哈代-温伯格平衡可能是由于实验样本数量偏少，或者本伊犁马群由于人工选择使带有T等位基因的个体被保留下来。另外本实验发现该位点处于中度多态，遗传变异较大，这表明GHR基因此多态位点有可能用于伊犁马的选育。目前，GHR基因在许多报道上都被证明为泌乳性状的候选基因，如马彦男等[9]验证GHR基因F279Y位点突变对中国荷斯坦牛泌乳性状的影响的结果显示，该位点突变AA型305 d产奶量显著高于AT型。马妍等[10]对 1 145头中国荷斯坦牛GHR基因F279Y位点进行多态性检测发现，对于产奶量和乳脂率，TT与AT基因型之间差异显著。孙瑞萍等[11]采用PCR-SSCP技术检测西农莎能奶山羊发现，在exon9上检测到了NN型和NT型2种基因型，在241 bp处发生了G→T的突变，并且在某些胎次的产奶量NN和NT基因型产奶量差异显著。而郭晓飞等[12]采用PIRA-PCR和RFLP法的研究也验证了上述研究的结论。不过也有许多研究发现，GHR基因多态性与产奶量并没有显著相关，而只与乳脂率、乳蛋白率等泌乳性状有显著相关；王丽娟等[13]的研究也印证了这一观点。目前，国内外对马GHR基因的研究比较少，尤其对GHR基因与泌乳性状的关联研究更是空白。

表2 伊犁马GHR基因型频率、有效等位基因数、杂合度、多态信息含量

泌乳性状作为一个数量性状，它的表现不仅受基因的影响，还有环境作用。而产奶量是一个遗传力极低的性状，常规的选育并不能使其大幅度提高，现如今分子遗传学的发展使得开展标记辅助选择更加便捷，而目前最重要的工作就是找到影响产奶量性状的候选基因。目前，国内外研究发现了大量存在于外显子和内含子中的变异，而这些突变也为标记辅助选择（MAS）提供了参考，但关于马泌乳性能的有效标记还没有发现，这也需要进行大量研究来寻找。

4 结 果

本实验首次对伊犁马GHR基因的启动子区和外显子区进行了SNPs检测，检测结果表明启动子区（T-562C）存在多态并且可以分为CC、CT、TT 3种基因型，虽然各基因型间产奶量差异不显著，但各基因型产奶量依次为TT>CC>TC，表明该突变与产奶量有一定的相关，可为我国乳用马的选育提供一定参考，但由于实验样本数量较少，还需要大量实验来证明。

[1]袁媛, 李苏宜. 生长激素相关肿瘤生物学效应的研究进展[J]. 肠外与肠内营养, 2010, (5):313-315.

[2] 陈宝定, 李琦华, 李丽红, 等. 生长激素与生长激素受体基因的表达[J]. 中国畜牧兽医, 2007, (11):52-54.

[3] 吴天成, 兰海楠, 马思慧, 等. 生长激素受体介导的信号转导机制研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2014, (12):186-189.

[4]Rahmatalla S A, Müller U, Strucken E M,et al. The F279Y polymorphism of theGHRgene and its relation to milk production and somatic cell score in German Holstein dairy cattle[J]. J Appl Genet, 2011, 52(4):459-465.

[5]Blott S, Kim J J, Moisio S,et al.Molecular dissection of a quantitative trait locus: a phenylalanine-to-tyrosine substitution in the transmembrane domain of the bovine growth hormone receptor is associated with a major effect on milk yield and composition[J]. Genetics, 2003,163(1):253.

[6]王凯, 柳广斌, 黄特民, 等. 中国南方荷斯坦奶牛TRAPPC9、DGAT1、GHR、ATP1A1基因多态性与产奶性状相关性分析[J]. 华南农业大学学报, 2016, (4):7-12.

[7] 邱峥艳, 孟纪伦, 芦春艳, 等. 草原红牛与中国荷斯坦牛GHR基因多态性及与产奶性状相关性分析[J]. 中国畜牧杂志, 2011, (13):18-20.

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[9]马彦男, 贺鹏迦, 朱静, 等.GHR基因F279Y位点突变对中国荷斯坦牛泌乳性状的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, (5):400-404.

[10]马妍, 贾晋, 张毅, 等. 荷斯坦牛GHR基因多态与产奶性状关联分析[J].畜牧兽医学报, 2009, (8):1186-1190.

[11]孙瑞萍, 王利心, 朱广琴, 等.GHR基因exon9和exon 10多态性与西农萨能奶山羊产奶性能的相关分析[J]. 中国农业大学学报, 2008, (5):70-74.

[12]郭晓飞, 徐小兵, 李秋玲, 等. 荷斯坦母牛生长激素受体基因F279Y突变与产奶性状的关联分析[J]. 安徽农业大学学报, 2015, (4):515-519.

[13]王丽娟, 李秋玲, 王长法, 等. 奶牛GHR基因CRS-PCR多态性及其与产奶性状的关联分析[J]. 农业生物技术学报, 2008, (6):936-940.

Polymorphism of GHR Gene and Its Correlation with Lactation Performance in Yili Horse

MENG Zhe1, YU Nong-qi1, GAO Yuan1, WU Ming-li1, FAN Ying-zhi1, LEI Chu-zhao1, LIU Wu-jun2, DANG Rui-hua1*

(1.College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100, China;2. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Xinjiang Urumqi 830052, China)

Mare's milk has a high nutritional value, but there are few research reports on lactation performance of horse until now. This trial was conducted to study the polymorphism of growth hormone receptor (GHR) gene in Yili horse and its relationship with lactation performance. 13 pairs of primers were designed for the exons and promoter ofGHRgene of Yili horse. DNA pooling was used as the template, and PCR product was directly sequenced. PCR-RFLP method was used to genotype the polymorphic sites in 188 Yili horses, and then the relationship between genotypes and lactation traits based on 73 of them was analyzed. The result showed that a T-562C mutation inGHRgene promoter was detected in Yili horse. The frequencies of genotype CC, TC and TT were respectively 0.309, 0.66 and 0.016, and C allele was dominant and its frequency was 0.646. The frequency of T gene was 0.354. The results showed that although the milk yield of each genotype was not signi fi cantly different (P>0.05), it was found that there seems to be a trend in the milk production of each genotype (TT> CC>CT). The mutation (C>T) could increase the milk yield. The results can provide an identi fi able ground for the Chinese dairy horse breeding ef fi ciently.

Yili horse;GHRgene; Lactation performance; Polymorphism

S821.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-029

2017-05-27；

2017-07-13

国家自然科学基金项目（81270439）；引进人才科研启动费（Z111021202）

孟吉吉（1996-），男，山东济宁人，本科生，研究方向为动物遗传育种，E-mail：nwsuaf_mengzhe@126.com

*通讯作者：党瑞华（1976-），男，陕西汉中人，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为动物遗传育种，E-mail：dangruihua@nwsuaf.edu.cn