糖皮质激素治疗对重症肌无力患者Tfh细胞亚群的作用

赵旭

（辽宁省海城市中心医院神经内二科，辽宁 海城 114200）

糖皮质激素治疗对重症肌无力患者Tfh细胞亚群的作用

赵旭

（辽宁省海城市中心医院神经内二科，辽宁 海城 114200）

目的 观察糖皮质激素治疗前后对重症肌无力患者Tfh细胞亚群的调控和影响。方法 选取2015年8月～2016年9月于本院由糖皮质激素治疗显著的患者30例以及健康对照组20例，采用流式细胞术的方法检测对比健康对照组，同一患者治疗前后外周血中CD4+T细胞CXCR5,ICOS以及转录因子Bcl-6的表达，ELISA的方法比较治疗前后血清中细胞因子IL-21的表达水平。结果 ①与健康对照组相比，新发MG患者Tfh细胞显著升高，而糖皮质激素治疗后显著降低；②新发MG患者相较于健康对照组，ICOS与Bcl-6表达显著上调，而糖皮质激素治疗后可以显著降低ICOS的表达水平；③新发MG患者血清中IL-21水平显著增加，糖皮质激素治疗后IL-21的水平较治疗前显著下降。结论①Tfh细胞的失衡可能参与重症肌无力的发病过程，其比例与MG的疗效相关。②糖皮质激素可能通过影响Tfh细胞IL-21的表达抑制自身抗体的产生治疗重症肌无力。

Tfh细胞；重症肌无力；糖皮质激素；IL-21

重症肌无力（myasthenia gravis,MG）主要发生于神经肌肉接头处的自身免疫性疾病，其发生机制是由于自身抗体与乙酰胆碱受体AChR或MuSK相结合导致神经肌肉传导受损最终导致肌肉无力[1-2]，因此自身反应性的B细胞及其产生的病理性抗体在MG发生发展过程中扮演着重要的角色[3-4]。而自身免疫性抗体的产生离不开CD4+T细胞的辅助。

Tfh（Follicular helper T cells），是最近发现的辅助性CD4+T细胞亚群，它主要存在于次级淋巴组织中，在生发中心与B细胞相互作用促进B细胞的亚型转化和抗体的产生。其分化依赖于转录因子Bcl-6，而发挥作用主要依赖于其产生的细胞因子IL-21[5-6]。Tfh细胞目前被报道参与多种自身免疫性疾病的发生[7-8]。糖皮质激素是重症肌无力目前临床上广泛采用的方法，但其作用机制目前仍然未知。本文拟通过比较新发重症肌无力与糖皮质激素治疗后患者外周血中Tfh细胞亚群，表型，转录因子以及细胞因子的分泌，初步了解重症肌无力中Tfh细胞亚群的变化与临床指标的相关性，并进一步了解MG的发病机制，深入研究糖皮质激素的作用机理。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年8月～2016年9月于本院神经内科就诊的确诊为重症肌无力患者30例，其中男19例，女11例，平均年龄（41.3±6.2）岁，纳入标准[9]：①晨起暮重的典型的重症肌无力临床症状；②疲劳实验及新斯的明实验为阳性；③接受糖皮质激素治疗后效果显著者。排除标准：①在接受糖皮质激素治疗前有过其它如免疫抑制剂或胸腺切除的治疗史；②明显肝肾功能不全者，严重感染（如HIV感染）、自身免疫性疾病以及恶性肿瘤者。另外纳入20例同期于本院保健科接收健康体检者作为正常对照，其中男12例，女8例，平均年龄（40.2±8.3）岁，两组患者在性别和年龄统计上差异无统计学意义，且所有纳入的患者均签订相应的知情同意书。

1.2 Tfh细胞的标记和染色 就诊当天空腹采集纳入重症肌无力患者治疗前和治疗后以及健康对照组EDTA抗凝的静脉血2 mL，分离外周血单个核细胞后，分别将购自BD公司的Alexa-488-anti-CXCR5，PE-anti-ICOS，PerCP-Cy5.5-anti-CD4对所分离的淋巴细胞室温标记，20分钟后对细胞进行固定、穿膜（利用购自eBiosciences的穿膜打孔试剂盒），取APC-anti-Bcl-6抗体室温避光穿孔1 h后，加入200 μL Hank’s缓冲液重悬细胞，于BD FACS Calibur流式细胞仪上机检测，并用Flowjo软件对所得结果进行分析。

1.3 ELISA检测血浆中IL-21表达水平 将上述采集的静脉血离心后分离血浆，分装至EP管中冻于-80℃冰箱保存，根据购自北京达科为公司的人IL-21 ELISA试剂盒说明书操作，检测患者和健康对照组血浆中IL-21的表达水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件对所得的数据进行处理，计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数（n）表示，组间率（%）的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖皮质激素治疗后MG患者外周血Tfh细胞比例变化观察新发MG患者与健康对照组相比，表1的结果显示，外周血CD4+细胞中，CXCR5的表达水平显著上调[（12.8±2.9）%vs（9.2±2.5）%]，且两者之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。糖皮质激素治疗后MG患者与自身治疗前相比，外周血中CXCR5的表达水平显著下调，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

进一步观察糖皮质激素治疗对MG患者外周血Tfh细胞表型ICOS以及转录因子Bcl-6的表达的影响。相比于健康对照组，新发MG患者外周血CD4+细胞表面ICOS的表达显著上调，而治疗后，显著下降。新发MG患者Tfh细胞转录因子Bcl-6的表达水平较对照组显著升高，而治疗后虽有下降趋势，差异无统计学意义，见表1。

表1 糖皮质激素治疗后Tfh细胞比例变化（x±s）Table 1 The Change of Tfh cells Percentage after Glucocorticoid Treatment(x±s)

2.2 糖皮质激素治疗后血浆中细胞因子IL-21表达水平的变化 采用双抗夹心法检测MG患者治疗前后血浆细胞因子IL-21的浓度，新发MG患者血浆中IL-21的浓度（210.8±80.3）pg/mL显著高于对照组（85.8±50.9）pg/mL（P＜0.05）。治疗后血浆中IL-21（160.5±60.2）pg/mL的表达水平显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 糖皮质激素治疗后血浆IL-21表达水平的变化（x±s）Table 2 The Change of Plasma IL-21 after Glucocorticoid Treatment(x±s)

3 讨论

滤泡辅助性T细胞作为最近新发现的辅助性T细胞亚群，在次级淋巴器官中可以诱导并辅助B细胞进入生发中心增殖分化形成浆细胞，并产生抗体[10]。研究发现，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等自身免疫病中均会出现Tfh的数量或者功能发生异常，且增高程度也与自身免疫病的严重程度呈现正相关的关系[11-12]。国外通过动物模型和临床样本的实验均发现，重症肌无力患者中Tfh细胞的分化均出现异常，而病情缓解后，会伴随着Tfh细胞比例恢复至正常水平[13-14]。

口服糖皮质激素目前广泛应用于MG患者的临床治疗，其作用的主要机制是降低细胞因子的分泌和抑制抗原提呈，抑制淋巴细胞的增殖和分化。本文通过比较新发MG患者与健康对照组以及同一患者糖皮质激素治疗前后Tfh细胞的比例、表型、转录因子Bcl6的表达以及血浆中IL-21的水平发现，新发MG患者中，相较于健康对照组，Tfh细胞比例，表面ICOS分子，转录因子Bcl6的表达显著上调，而治疗显著后Tfh细胞明显降低。暗示着Tfh细胞可能参与到重症肌无力的发病过程中。

转录因子Bcl-6被报道可以参与促进Tfh细胞的分化，本实验的结果发现，新发的MG患者Tfh细胞转录因子Bcl-6的表达相较于健康对照组显著升高，而糖皮质激素治疗后并降低Tfh细胞中转录因子Bcl-6的表达。而国内崔亚杰等最近研究发现，在口服泼尼松治疗有效的MG患者中，外周血Bcl-6的mRNA表达水平显著下调[15]。暗示着泼尼松的治疗可能是通过抑制Bcl-6的表达抑制Tfh细胞的分化来抑制Tfh细胞产生，而我们的文章中糖皮质激素治疗后虽然Bcl-6的表达水平呈现显著下降的趋势，但并未有显著性差异，其是否是与泼尼松的作用机制相类似，还有待接下来进一步研究。

IL-21主要由Tfh细胞产生，促进B细胞发育成熟以及抗体的产生。在本实验的研究中发现，新发MG患者血清中IL-21的水平显著高于健康对照组，而糖皮质激素治疗后显著下降，暗示着糖皮质激素治疗可能是通过抑制Tfh细胞产生IL-21，减少浆细胞的分化以及自身免疫性抗体的产生。

综上所述，我们的研究发现Tfh细胞可能参与MG患者发病的过程，而糖皮质激素治疗效果显著的患者中Tfh细胞显著降低，暗示着Tfh细胞的变化与临床疗效有显著相关性。

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doi:10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.014

The Impact of Glucocorticoid Treatment on Tfh Cell in Myasthenia Gravis Patients

Zhao Xu
(Haicheng Central Hospital,department of internal neurology,Haicheng,Liaoning,114200,China)

Objective To explore the potential effects of glucocorticoid treatment on Tfh cell population in myasthenia gravis patients.Methods 30 patients newly diagnosed with myasthenia gravis and treated in our hospital as well as 20 healthy controls from Oct 2015 to Sep 2016 were given oral glucocorticoid treatment.Changes of CXCR5,ICOS and transcriptional factor Bcl-6 were determined by flow cytometry.Serum IL-21 was measured by ELISA.Results①Compared with healthy controls,the percentage of Tfh cells were significantly elevated and decreased after glucocorticoid treatment;②The expression of ICOS and Bcl-6 was significantly higher in MG patients compared with healthy controls,however,only the level of ICOS was significantly down-regulated after glucocorticoid therapy;③Serum IL-21 was significantly higher in MG patients compared with control littermates and glucocorticoid treatment could obviously returns to normal level.Conclusion①The imbalance of Tfh cells may take part in the pathogenesis of MG occurrence and correlated with clinical therapeutic outcome;②Glucocorticoid treatment may inhibit autoantibody production through inhibiting the secretion of IL-21 by Tfh cells.

Tfh cells;Myasthenia gravis;glucocorticoid;IL-21