别紧张，放松肌肉测定动物尿液中天然类固醇和合成类固醇

文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

别紧张，放松肌肉测定动物尿液中天然类固醇和合成类固醇

文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

图1：在家畜育肥过程中，除常规饲料外经常有人使用违禁饲料，例如，类固醇类药物。

德国动物及动物源食品中的残留物监控计划NRKP是国家保护消费者健康计划，并由欧盟于1989年作为统一标准在欧盟内部颁布实施。该计划需要对肉用家畜体内的有害物质进行检测。在该背景条件下，德国化学兽医检验局CVUA-MEL承担定期抽取动物尿液检测类固醇任务。

德国化学兽医检验局CVUA-MEL专业领导人Thorsten Bernsmann博士表示：“欧洲禁止将类固醇作为动物饲料添加剂。即便合成类固醇在尿检中只有很低浓度。该类物质中的每种类固醇最低检测限，也就是‘推荐浓度’值只有每升尿液1 μg，实现如此低的检测限必须在检测分析前进行样本制备。”

人工手动提纯费时费力

检测动物尿液中类固醇样本制备工作繁琐，因为，需要完成两道固相萃取操作：首先是尿液样本离心浓缩，以便分离出固体杂质。

图2：将尿液样本、SPE固相萃取柱与两个洗脱皿放入Freestyles自动化样本制备系统中并开始制备样本。第一次水解样本萃取物提纯作为磁性固相提纯，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用浓度为5%的甲醇清洗、纯甲醇洗脱；其中，洗脱出的第一毫升洗脱液不必丢弃并不能用于检测分析。第二次提纯是非磁性固相萃取，利用NH2 SPE固相萃取柱。萃取提纯自动完成，最后，只需对样本进行蒸发浓缩，在检测分析前再用溶剂溶解开来。

然后，需要用酸碱度pH值缓冲剂调节样本，使尿液样本在葡萄糖醛酸酶及芳基硫酸酯酶的酶化作用下水解。通过水解，附着在糖分子上的类固醇就会脱离出来形成游离状类固醇，这样就可以在后续检测过程中被检出。

Bernsmann博士解释：“第一次水解样本萃取物提纯是磁性固相提纯，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用浓度5%甲醇清洗，纯甲醇洗脱；其中，洗脱出的第一毫升洗脱液必须丢弃、不能用于检测分析。第二次提纯是非磁性固相萃取，使用的是NH2SPE固相萃取柱。将洗脱液收集起来，在蒸发器中蒸发，再用稀释剂溶解，最后，才可用于检测分析。”

Bernsmann博士表示：“自2015年起我们就在CVUA-MEL德国化学兽医检验局中按照上述方式人工手动进行肉用家畜尿液类固醇检测。这是一项非常耗费时间的检验分析工作：大约24份样本就需要一名实验员忙活一整天。样本注入固相萃取柱后状态不同，因为，它们浓度不同。在人工手动准备样本时实验员可以调节真空度；但他需要照顾到每一个样本，因为一次要处理多个样本。当一份样本缓慢的流过SPE萃取柱、需要加大真空时，另一份样本则顺利的流过了萃取柱。而实验员要避免固相萃取柱中没有液体的空流动。”

图3：为减轻实验室工作人员的劳动强度，减少两次固相萃取工作量，德国化学兽医检验局CVUA-MEL不久前引进自动化样本制备设备——模块化机器人系统：Freestyle，用来测定动物尿液中的类固醇。

本刊提示：压力较高的好处

固相萃取技术能够完成从难以提取检测物质样本中提取检测样本，使实验室人员能够处理含有悬浮物或长丝基质材料，例如，含有沉积物的河水。

软件轻松制定出检测分析方法

从2015年2月份开始，CVUAMEL德国化学兽医检验局开始用自动化样本制备方式代替费时费力的人工手动操作；所使用的样本制备仪器设备是LC-Tech公司的Freestyle系统。该模块化机器人检测分析仪所使用的软件专门针对样本制备而设计，LC-Tech公司的工艺技术开发工程师Sebastian Wierer先生表示：“它的最大特点是：两个固相萃取交替工作，将其不同的工作方法整合到一起（称之为SPE双柱萃取法）。为实现该目标，我们对该系统控制软件进行了具有针对性的设计改进，将其控制在两个不同萃取柱中进行固相萃取。”

借助于该软件技术改进，促使软件技术控制的双柱萃取控制、调整变得异常简单：“在软件界面窗口中，萃取过程所用的必要参数均显示于此。只需点击鼠标就可以选择操作步骤并设置例如流量及压力参数，从而定义下一个操作模式。一旦将该模式保存下来，您便可以随时在实验室中调取出并使用。” 为高效而快捷的完成样本提纯，CVUA-MEL德国化学兽医检验局为制备该类样本使用的是Macherey Nagel公司研发生产的Chromabond固相萃取柱。

Macherey Nagel公司的应用技术专家Hans Reiner Wollseifen博士介绍：“该种固相萃取柱不仅可以在系统方法研究样本制备中使用，也可以在标准常规检验过程样本制备中使用。”该种固相萃取柱的基本材料保证其能够高效浓缩与提纯，并具有理想的流动性、最佳的微孔结构和很高的比表面积，适用于低试剂消耗量检测分析使用。

Wierer先生表示：“为提高流量及减小萃取柱的无效空间，我们设计出了Chromabond固相萃取柱专用柱塞杆。没有这一专用柱塞杆，萃取柱中的高流量常常需要等待，直至柱床上清液排空为止。目前，则可以对柱中萃取液、清洗液及洗脱液施加恒定压力。”

图4：德国化学兽医检验局CVUA-MEL利用Machery Nagel公司研发生产的Chromabond固相萃取柱进行样本提纯。这一萃取柱非常适合于在机器人系统中高效的、快捷的完成样本提纯。为了减少萃取柱中的死角，提高流量，LC-Tech公司专门设计了覆盖在固相萃取柱上的专用柱塞杆。

较小的工作量就便可获得更准确的检测信号

在自动化样本制备过程中，已水解的样本、带有专用柱塞杆的SPE萃取柱及两个洗脱皿都要放入自动化设备中。第一个洗脱皿用于首次固相萃取后短时间接纳一部分样本。在选择接纳第二次固相萃取样本洗脱皿时应注意：该洗脱皿应能在Turbovap浓缩仪中蒸发浓缩。

Bernsmann博士解释：“设备启动后，仪器设备能够自动完成上述介绍的两个提纯步骤；只剩样本的蒸发浓缩和用另一种溶剂重新溶解。向Freestyles设备中放置器皿和样本的工作，启动一系列样本制备的流程所需的时间仅仅是人工手动操作很小的一部分时间。而这种方法的制备出来的样本就是手工制备的感觉一样好。留给实验员从事其他工作的时间，通过自动化样本制备明显节约实验分析的时间”在同一过程中能够完成处理18个样本。

测量信号的稳定性明显有所提高，所有试剂均在恒定压力下流经萃取柱与人工手动操作检测结果相比，检测结果标准偏差明显降低；自动化系统具有比人工手动更高的可重复再现性及稳定性。样本在不同浓度、粘度几乎不成问题。

Bernsmann先生表示：“除恒定压力与检查结果的可重复再现性能外，改用自动化样本制备系统同样带来其他优点及好处。就像人工手动操作，使用LCTech公司的自动化设备一周仅制备50个样本，但采用Freestyles系统后明显减少人力资源占用。原来人工手动执行的、费时费力的SPE固相萃取与技术开发工作也可以在夜间自动进行。无人值守的样本制备可以在周末进行。另外，检测分析结果同样证明该系统工作绝无交叉污染。使用自动化样本制备系统意味赢得效率；CVUA-MEL德国化学兽医检验局职工可以在Freestyles系统自动工作期间从事其他没能实现的自动化工作。

在动物饲料中添加违禁成分，例如，类固醇类成分，从而实现催肥增膘快速出栏的事件并不少见。阅读本文，您会更详尽了解到利用自动化固相萃取技术明显提高类固醇检测效率的有效方法。

本文作者Sebastian Wiererm先生系Obertaufkirchen市，LC-Tech有限责任公司职工。Hans Rainer Wollseifen博士系Dueren市，Machery Nagel有限两合公司职工。