铁皮石斛共生真菌对不同碳源的适应性

徐超　张红岩　杨鹤同　席刚俊

摘要：以蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、淀粉作为培养基中的碳源，探索铁皮石斛共生真菌对不同碳源的适应性。结果发现，以蔗糖、葡萄糖作为碳源时，各种共生真菌的生长速度较快、菌丝干质量较高。蔗糖、葡萄糖为适用于铁皮石斛共生真菌的外源碳源，考虑到成本，使用蔗糖更为适宜。

关键词：铁皮石斛；共生真菌；碳源

中图分类号： S56723+901文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0147-02

收稿日期：2016-06-01

基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2014385）；江苏农林职业技术学院科技创新团队项目（编号：2015kj036）。

作者简介：徐超（1979—），男，博士，副研究员，长期从事铁皮石斛等植物共生菌的相关研究。E-mail：cxu8888@126com。

通信作者：席刚俊，男，助理研究员，主要从事铁皮石斛栽培技术研究。E-mail：xigangjun@163com。

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生附生草本植物1]，具有很好的滋阴润肺、抗肿瘤等功效2]，被誉为“中华九大仙草”之首3-4]。作为典型菌根共生植物，共生真菌主要寄生于铁皮石斛的种子及根系上5-6]。碳源是生物细胞骨架构建的主要物质，也是细胞生命活动所需能源的主要提供者，因此微生物的正常生长和代谢离不开碳源。由于不同菌种代谢能力不同，对碳源的利用存在差异，导致不同菌种对各种外源碳源的适应性可能有所区别7]。目前，关于铁皮石斛专用生物菌肥的相关报道较少。本研究通过探索铁皮石斛共生真菌对不同外源碳源的适应性，进而筛选出适宜的外源碳源，为制备铁皮石斛菌根菌剂提供参考。

1材料与方法

11试验材料

供试碳源：蔗糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖。

供试菌种：铁皮石斛共生真菌001、002、003，保存于江苏农林职业技术学院生物工程技术中心。

12培养基制备

121固体培养基固体基础培养基（PDA）：马铃薯200 g、琼脂15 g，酸碱度自然，水1 000 mL8]。将供试外源碳源蔗糖、葡萄糖、淀粉和麦芽糖分别加入基础培养基中，制成添加不同外源碳源的培养基。其中，每种碳源设5个浓度梯度：依次为1%、2%、3%、4%、5%；同时，每个梯度各设3次重复9]。将制备好的培养基分装于150 mL三角瓶中，然后进行湿热灭菌（121 ℃，20 min）。

122液体培养基液体基础培养基（PD）：马铃薯200 g、酸碱度自然，水1 000 mL8]。不同外源碳源的添加方式和浓度梯度设置与以上固体培养基的制备方法相同。

13铁皮石斛共生真菌的人工接种及培养

将制备好的添加不同外源碳源的培养基倒在培养皿内（直径90 mm），约15 mL皿；用灭菌的打孔器（直径4 mm）将预先在PDA上培养好的菌种打成菌饼，接种到PDA平板中央和液体培养基中，黑暗培养7 d（27 ℃，PRX-250A智能人工气候箱）。

14測量方法

141菌落生长速度根据“13”节的操作步骤，黑暗培养 7 d 后，测量共生真菌在固体培养基上的菌落直径，作为衡量菌落生长速度的参考指标。每种处理设5个重复。

142菌丝体干质量根据“13”节的操作步骤，黑暗培养7 d后，将液体培养基中的菌丝体取出，烘干后称质量，作为衡量菌丝干质量的参考指标（60 ℃，24 h，DGG-9240型电热恒温鼓风干燥箱）。

2结果与分析

21不同外源碳源对铁皮石斛共生真菌菌落的影响

研究发现，在人工培养过程中，铁皮石斛共生真菌对4种供试外源碳源都可利用，但菌落的生长速度不同。其中，001菌株在添加蔗糖、葡萄糖的培养基中，生长较好，菌落最大直径分别为718、727 cm；在添加淀粉的培养基中生长最差，最大菌落直径仅为571 cm；002菌株在添加蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉的培养基中均生长较好，菌落最大直径均为 900 cm；003菌株在添加蔗糖、葡萄糖和麦芽糖的培养基中生长较好，最大菌落直径均超过880 cm，而在添加淀粉的培养基中生长稍差，最大菌落直径仅为810 cm（表1）。

综合以上结果，3种铁皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培养基上生长状况均较好，菌落直径较大。因此，蔗糖、葡萄糖为适用于铁皮石斛共生真菌的外源碳源。

22不同外源碳源对铁皮石斛共生真菌菌丝干质量的影响

研究发现，在液体振荡培养过程中，铁皮石斛共生真菌对4种供试碳源都可利用，但碳源差异对铁皮石斛共生真菌菌丝干质量的影响较大。在添加蔗糖、麦芽糖的培养基中进行人工培养时，3种供试真菌的菌丝体干质量均有一定优势；而在添加葡萄糖、淀粉的培养基中进行人工培养时，各供试共生真菌的菌丝体干质量明显较低。其中，001菌株在添加蔗糖、麦芽糖的培养基中进行人工培养时，生长状况均较良好，菌丝体的最大干质量均在 050 g皿左右， 最适浓度为5%， 而在添加葡萄糖、淀粉的培养基中进行人工培养时，菌丝体的最大干质量均低于040 g皿；002菌株在添加蔗糖、麦芽糖的培养基中进行人工培养时，菌丝体最大干质量均超过 025 g皿，最适浓度为1%。003菌株在添加蔗糖、麦芽糖的培养基中进行人工培养时，菌丝体的最大干质量均接近 07 g皿，最适浓度为4%，而在添加葡萄糖、淀粉的培养基中进行人工培养时，最大干质量均不足05 g皿（表2）。

综上可见，3种铁皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培养基中进行人工培养时，共生真菌的菌丝干质量均较大。因此，蔗糖、葡萄糖为适用于铁皮石斛共生真菌生长的碳源。

3结论与讨论endprint

通过对铁皮石斛共生真菌的菌落生长速度和菌丝体干质量进行测定，发现在以蔗糖作为碳源时，铁皮石斛共生真菌的生长速度和菌丝干质量均较优；当以葡萄糖作为碳源时，虽然菌落生长较快，但生长势较弱，菌丝干质量相对较低，这可能和菌种间的差异性有关。此外，与蔗糖相比，麦芽糖、葡萄糖的价格相对较高。综合以上因素，确定蔗糖为适用于铁皮石斛共生真菌的外源碳源。

目前，铁皮石斛的组培技术基本成熟，但其组培苗移栽成活率低、生长缓慢，可能与缺少共生真菌有关10-11]。在铁皮石斛人工栽培过程中，优良菌根菌剂的使用不仅对铁皮石斛存活率具有显著影响，对其产量的提高、抗旱性的增强也具有至关重要的作用12]；同时，共生真菌形成优势菌群后，释放的拮抗物质可阻止其他病原菌侵入植物体内，大大减轻植物感染病害的风险13]。陈海荣等研究发现，在紫云英根瘤菌培养基的选择与优化过程中，无机碳源中蔗糖和甘露醇为比较理想的碳源，表明不同真菌的培养条件既有共性，也有菌株个性，对相同碳源的吸收和利用率不尽相同，对不同碳源的吸收效果也存在较大差异14]。因此，在铁皮石斛的人工栽培过程中，使用优良的菌根菌剂是有益的；但在进行菌根真菌扩繁和菌剂制备时，为了提高菌剂生产效率，降低生产成本，预先进行菌根真菌培养条件的筛选和优化10]，逐步筛选经济、实用、高效的基质配方是十分必要的，也是必不可少的试验内容。

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