黑曲霉天冬氨酰氨肽酶的分子克隆与酶学性质解析

乔雅丽，董自星，2，*，宋鹏，刘晓光，2，路福平

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津科技大学化工与材料学院，天津300457）

黑曲霉天冬氨酰氨肽酶的分子克隆与酶学性质解析

乔雅丽1，董自星1，2，*，宋鹏1，刘晓光1，2，路福平1

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津科技大学化工与材料学院，天津300457）

以黑曲霉CICIM F0510的互补DNA（complementary DNA，cDNA）为模板，通过PCR扩增出一个新的天冬氨酰氨肽酶基因（vacuolar aspartyl aminopeptidase，vaap），并成功将其在毕赤酵母GS115中进行表达。摇瓶水平上，重组菌GS115（pPIC9K-vaap）的氨肽酶酶活达到39.7 U/mL。该酶的最适反应温度和pH值分别为55℃和9.5；在90℃或pH 8.0～10.0孵育1 h后，该酶仍能保持20%或80%以上的酶活；Sn2+和Co2+对其酶活有明显促进作用，Fe3+、Ca2+、EDTA和SDS对其有抑制作用；该酶对L-亮氨酰对硝基苯胺（Leu-pNA）的Km和Vmax分别是12.96 mmol/L和2.14 μg/（mL·min）。在所测的8种底物中，Leu-pNA是Vaap最适底物，且它对丙氨酸对硝基苯胺（Ala-pNA·HCl）和赖氨酸对硝基苯胺（Lys-pNA·2HCl）也有一定的水解能力。

天冬氨酰氨肽酶；黑曲霉；分子克隆；酶学性质

氨肽酶（Aminopetidases，EC 3.4.11）是一类外切蛋白酶，能水解蛋白或多肽链的N端特定肽键，释放出相应的游离氨基酸[1]。不同氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力存在差异性，同一种氨肽酶对不同的N端氨基酸残基的水解能力也不同。根据底物特异性的不同，可将氨肽酶细分为天冬氨酰氨肽酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶等[2]。氨肽酶由于其独特的水解和脱苦性能，在食品工业中特别是营养保健品和调味品的制造方面潜力巨大。与其它蛋白酶复合使用可以深度水解蛋白质，促进良好风味的形成[3-4]；运用氨肽酶和蛋白质酶解程度控制工艺，可制备多种功能性多肽[5]；部分特殊种类的氨肽酶还可用作医学上的解毒剂或环境消毒剂[6]。

氨肽酶广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中。由于动植物体内氨肽酶含量低、成分复杂，氨肽酶的提取成本较高。因此，利用微生物发酵法生产氨肽酶成为当今的研究热点之一。目前，我国还没有实现氨肽酶的自主生产，工业上使用的氨肽酶主要由丹麦诺维信、日本田野等公司生产，价格昂贵，影响了我国相关产业的发展。据报道，目前已有多种不同微生物来源的氨肽酶被克隆表达，主要是真核和原核微生物[2]。其中，已被克隆表达的黑曲霉氨肽酶有以下4种：赖氨酸氨肽酶（ApsA）[7]、二肽基氨肽酶（DapB）[8]、脯氨酸氨肽酶（PapA）[9]和苯丙氨酸氨肽酶（ApsC）[10]。

尽管黑曲霉CBS 513.88的基因组序列已经于2007年解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白数据库中还有许多蛋白的功能未确定。目前已报道的天冬氨酰氨肽酶主要来源于哺乳动物[12]、酵母[13]和米曲霉[14]等，而黑曲霉、植物和细菌来源的天冬氨酰氨肽酶未见报道。本文通过对黑曲霉基因组信息进行分析，发现了一个新的编码天冬氨酰氨肽酶的基因序列，通过分子克隆技术成功将该基因在毕赤酵母中进行了克隆与表达，并系统解析了其酶学性质。为进一步阐明其耐热和耐碱机制以及挖掘其应用价值等奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

黑曲霉（Aspergillus niger）CICIM F0510：中国高校工业微生物资源与信息中心；大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 和质粒pPIC9k：保藏于天津科技大学生物催化与生物转化研究室；黑曲霉采用CD培养基进行培养，大肠杆菌的培养用LB培养基；毕赤酵母重组菌的培养基和培养方法按照Invitrogen的毕赤酵母操作手册进行。

1.2 主要试剂

限制性内切酶 Xba I、Sac I、Stu I 以及 PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA连接酶：宝生物工程（大连）有限公司；蛋白质分子量标准参照物：美国Thermo公司；质粒快速提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司；cDNA合成试剂盒：Roche公司；G418、真菌RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒：Invitrogen公司；化学合成底物Leu-pNA、GlupNA、Arg-pNA·2HCl、Lys-pNA·2 HCl、Met-pNA·HCl、Ile-pNA·2HCl、Pro-pNA·HCl和 Ala-pNA·HCl：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 基因克隆与重组菌的构建

质粒、PCR产物的纯化、酶切、连接、电转化以及转化子的筛选等均采用实验室常规方法进行[15]。基因克隆过程中所用引物（vaap1：5’-GTAGCCAAGAAGAACATCATGGGCC-3’；vaap2：5’-TGCTCTAGACTAAAAGTCAGCAAACTCCTTGTCAATCTCC-3’；下划线部分为人工引入的限制性酶切位点）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。黑曲霉总RNA的提取与cDNA制备按照试剂盒说明书进行。

1.4 重组酶的诱导表达与制备

将毕赤酵母重组菌GS115（pPIC-vaap）在YPD平板上进行纯化，挑取单菌落接种于25 mL YPD液体培养基中，于30℃、220 r/min振荡培养至对数期（OD600=2.6，约18 h～20 h）。按1%接种量转接于25 mL BMGY培养基，再于30℃、220 r/min振荡培养至对数期（OD600=2.6，约 16h～18h）。室温下5 000r/min离心5 min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0，于30℃继续培养并开始诱导。每隔24小时补加100%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导。每隔24小时取样一次，并测定酶活，直至120 h。发酵结束后，离心（4℃，8000r/min）收集上清液，即为粗酶液，于-20℃保存。将粗酶液用30%～70%的硫酸铵分级沉淀后，再用截留分子量为50 kDa的透析袋透析，从而对重组氨肽酶Vaap进行初步纯化。

1.5 重组氨肽酶活力测定

重组氨肽酶的酶活测定按照文献方法进行[17]。其一般步骤是：将酶液用50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）进行适当稀释，取稀释液0.4 mL，加入6 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。40℃下预热5 min后，加入0.4 mL 26 mmol/L L-亮氨酰对硝基苯胺（LNA）乙醇溶液。空白对照中加入0.4 mL的无水乙醇，水浴反应10 min。反应结束后立即取出，冰浴5 min终止反应。测定反应液在405 nm波长下的吸光值。酶活定义为：在40℃下，单位体积的酶液在单位时间内水解底物生成1 μg对硝基苯胺所消耗的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.6 重组酶酶学性质与特征分析

1.6.1 最适温度的测定

在不同温度（20、30、40、45、50、55、60、65、70 ℃）pH 8.0的条件下测定酶活，考察温度对重组酶酶活的影响。

1.6.2 最适pH值的测定

在不同 pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）和50℃测定酶活，考察pH值对酶活的影响。所用缓冲液为：0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和 0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.0、9.5、10.0、10.5）。

1.6.3 温度稳定性的测定

分别将经过适当稀释的重组酶酶液在40℃～90℃下保温0.5、1、2、3 h，按酶活测定方法在最适pH值条件下测定残留酶活。以未进行热处理的酶液酶活力为100%，计算相对酶活，考察重组酶在不同温度条件下的稳定性。

1.6.4 pH值稳定性的测定

分别将酶液在 pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液中保温1 h，在最适温度下测定剩余酶活，考察重组酶在不同pH值条件下的稳定性。

1.6.5 金属离子和化学试剂对酶活的影响

分别在重组酶与底物进行反应的体系中加入终浓度为0.1 mmol/L和1 mmol/L的金属离子（Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Sn2+和 Fe3+） 或终浓度为 1 mmol/L 的化学试剂（EDTA和SDS）。以未加金属离子的反应体系的酶活为100%，计算相对酶活力。

1.6.6 动力学参数的测定

分别以不同浓度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）的 L-亮氨酰对硝基苯胺为底物，在重组酶的最适作用温度和pH值条件下进行反应，然后按照1.5的方法进行酶活测定。并采用双倒数法（Lineweaver-BurK法）作图，计算出米氏常数Km及最大反应速度Vmax。

1.6.7 底物特异性分析

分别以 1 mmol/L 的 Leu-pNA、Glu-pNA、ArgpNA·2HCl、Lys-pNA·2HCl、Met-pNA·HCl、Ile-pNA·2HCl、Pro-pNA·HCl和 Ala-pNA·HCl） 为底物进行反应，按1.5所述方法测定酶活。以Leu-pNA为底物时测定的酶活为100%，计算其它底物的相对酶活。

1.7 序列测定与分析

基因的核苷酸序列测定采用Sanger法[16]进行，所测得序列，经DNASTAR拼接，利用DNAMAN初步分析。利用软件Clustal X2和Bioedit 7.0.9将vaap的氨基酸序列与其它来源天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列进行比对，并通过软件MEGA 4.0以邻近法（Neighbourjoining）构建进化树，分析它们亲缘关系的远近[17]。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉天冬氨酰氨肽酶基因vaap的克隆与序列分析

采用BLAST等分析方法对A.niger CBS 513.88的基因组序列（EMBL AM270980-AM270998）进行分析，发现了一个新的氨肽酶基因（vacuolar aspartyl aminopeptidase，vaap）。以此为基础，设计出相应的核苷酸引物。然后以A.niger CICIM F0510的cDNA为模板对其进行PCR扩增。PCR产物经纯化后，用Xba I进行完全酶切，并与经过SnaB I和Avr II酶切的pPIC9K进行连接。再通过Pst I酶切，验证了重组质粒的正确性，获得了重组表达质粒pPIC-vaap。进一步通过核苷酸序列测定，确认了所克隆的vaap基因具有完整的开放阅读框（ORF），且其核苷酸序列和氨基酸序列与A.niger CBS 513.88基因组公布的序列完全一致。该基因的大小为1551 bp，编码516个氨基酸。

将不同来源的天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列进行比对，结果如图1所示。

AnVaap 与 AkDap、AfDap、AlDap、OcDap、TmVaap和ScLap的氨基酸序列相似度分别为99.42%、84.77%、84.80%、70.59%、69.17%和40.67%。在它们的氨基酸序列中，保守的组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基分别有3个、5个和2个（图1中方框标出的氨基酸残基）。组氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸通常是锌离子的配体[18]，所以上述这些保守的氨基酸残基可能与Vaap的活性中心和锌离子结合位点有关[13，19]。通过与Homo sapiens天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列进行比对，可知底物结合口袋的关键氨基酸残基为His390、Tyr400、Ser415和Met422[20]。箭头标出的氨基酸残基只在天冬氨酰氨肽酶中是保守的（是Lys），而在M18家族的其它酶中不是保守的，而且这个位点的氨基酸残基可能对酶的底物特异性起决定作用[13]。进化树构建的结果表明，天冬氨酰氨肽酶Vaap与酵母氨肽酶I（ScLap）的亲缘关系比较近，同属于金属蛋白酶的M18家族，见图 2[13]。

2.2 黑曲霉氨肽酶Vaap在毕赤酵母中的高效表达

将重组质粒pPIC-vaap经限制性酶Sal I线性化后，电转化入毕赤酵母GS115中，并通过G418平板筛选高拷贝转化子，获得重组菌GS115（pPIC-vaap）。在250 mL摇瓶培养120 h后，重组菌的胞外氨肽酶酶活达到最高，为39.7 U/mL。通过盐析和透析，将发酵制备的粗酶液进行了初步纯化，SDS-PAGE分析的结果表明（图3），Vaap的纯度已经达到酶学特征分析的要求；其分子量约为55.0 kDa，与理论分子量大小相符。

2.3 重组氨肽酶的酶学特征

2.3.1 最适反应温度和热稳定性的测定

温度对Vaap的酶活和稳定性的影响见图4。

图1 不同来源天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of aspartyl aminopeptidases from different microorganisms

图2 进化树描述不同来源的天冬氨酰氨肽酶的遗传距离Fig.2 Phylogenetic tree describing the genetic distances among various aspartyl aminopeptidases from different microorganisms

图3 蛋白电泳分析重组酶Vaap的纯化效果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant enzyme Vaap

图4 温度对Vaap的酶活和稳定性的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of Vaap

在不同温度（20℃～70℃）下测定氨肽酶的酶活，结果如图4a所示。Vaap的最适作用温度是55℃，在30℃～55℃其相对活力达到80%以上，从20℃～70℃相对酶活力均达到60%以上，显示该酶具有较宽泛的作用温度范围。

热稳定性的研究结果如图4b所示，Vaap在40℃～80℃保温30min后，剩余酶活力在60%以上；在40℃～60℃保温3 h剩余酶活力仍在50%以上；而在90℃孵育30 min后，其酶活仍能保留40%左右，表明其热稳定性较好。该酶的最适反应温度和热稳定性高于A.oryzae天冬氨酰氨肽酶的最适反应温度（50℃）和热稳定性（80℃孵育1 h，酶几乎完全失活）[14]。Vaap是目前已报道的少数耐热氨肽酶之一，良好的耐热性使得该酶可以提高化学反应速率、降低成本、简化工艺、提高产品质量、活性稳定和耐贮藏等优点[21]。因此，Vaap具有更广阔的应用前景。

2.3.2 最适作用pH值和pH值稳定性的测定

pH值对Vaap的酶活和稳定性的影响见图5。

图5 pH值对Vaap的酶活和稳定性的影响Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of Vaap

在不同pH值（pH 5.5～10.5）的反应体系中测定酶活，结果汇总于图5。Vaap在pH 9.5下表现出最高活力，而在pH 8.5～10.0相对酶活达到80%以上，在酸性条件下水解活性很低，表明该酶是一种碱性氨肽酶。如图5所示，Vaap在pH 8.0～10.0条件下相对稳定，孵育1 h后残留酶活仍保持在60%以上；在pH 9.5时最稳定，保留有96.77%的活性，说明该酶的pH值稳定范围在8.0～10.0，与其发挥活性的pH值范围相同。与该酶相比，米曲霉、酵母和哺乳动物（如兔子脑细胞）来源的天冬氨酰氨肽酶的最适反应pH值和pH值稳定范围均偏中性[12-14]。

2.3.3 金属离子和化学试剂对酶活的影响

不同金属离子或化合物对酶活的影响如表1所示。

0.1 mmol/L 和 1 mmol/L 的 Zn2+、Co2+以及 1 mmol/L Sn2+对Vaap的酶活有促进作用，而这两种浓度的Fe3+和Ca2+对酶活有不同程度的抑制作用。SDS对该酶有强烈的抑制作用。与酵母和米曲霉的天冬氨酰氨肽酶[13-14]相同，该酶的活性受到金属螯合剂EDTA的明显抑制，而哺乳动物来源的天冬氨酰氨肽酶的酶活不受EDTA的影响[12]，表明该酶是一种金属离子螯合酶。

表1 金属离子或化学试剂对Vaap酶活的影响Table 1 Effect of metal ions or chemicals on the enzymatic activity of Vaap

2.3.4 动力学参数的测定

以不同浓度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）的 L-亮氨酰对硝基苯胺为底物，在最适温度和pH值条件下进行反应，然后按照1.5所述方法测定酶活，以1/V对1/S作双倒数图。根据双倒数图，计算获得该酶的米氏常数Km值为12.96 mmol/L，最大反应速度Vmax为2.14 μg/（mL·min）。其中，Km值远高于兔子脑细胞天冬氨酰氨肽酶对不同底物的 Km值（0.05 mmol/L～8.4 mmol/L）[12]，表明其底物亲和力较低。这可能是由于所用的底物不同造成的，如Asp-Ala-Ala-Leu和Asp-Ala-Asp-Leu等三肽。

2.3.5 底物特异性研究

分别以8种不同的aminoacyl-pNAs为底物，研究重组氨肽酶的底物特异性，结果汇总于图6。

由图6可知，在8种底物中，Leu-pNA为Vaap的最适作用底物，Vaap对 Ala-pNA·HCl和 Lys-pNA·2HCl也有一定的水解能力，对其余底物无水解作用。该酶对 Asp-pNA·HCl、血管紧张素 I（Angiotensin I）和血管紧张素II（Angiotensin II）等底物的水解作用还有待进一步研究。

图6 重组氨肽酶的底物特异性Fig.6 Substrate specificity of recombinant aminopeptidase

3 结论

本研究首次将黑曲霉CICIM F0510来源的天冬氨酰氨肽酶基因vaap在毕赤酵母中进行了克隆表达，并对其基本酶学性质进行了系统解析，包括最适反应温度和热稳定性、最适反应pH值和pH值稳定性、金属离子对酶活的影响、动力学参数和底物特异性等。摇瓶水平上，重组酶的最高酶活为39.7 U/mL。酶学性质的研究表明，该酶的最适反应温度和pH值分别为55℃和9.5；在90℃孵育30 min后，其酶活仍能保留40%左右，而且在pH 8.0～10.0孵育1 h后残留酶活在60%以上。良好的耐热性和耐碱性使得该酶在工业应用中具有降低成本和简化工艺等优点，应用前景十分广阔。这为后续挖掘其应用价值以及解析其耐热和耐碱机制提供了基础材料。

[1]梁二宾.氨肽酶产生菌的鉴定、酶的分离纯化及性质研究[D].广州:华南理工大学,2014

[2]高新星.枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究[D].无锡:江南大学,2014

[3]付静.食品外肽酶的研究进展[J].食品科学,2013(7):349-354

[4]Zhang L,Cai Q F,Wu G P,et al.Arginine aminopeptidase from white shrimp(Litopenaeus vannamei)muscle:purification and characterization[J].Eur Food Res Technol,2013,236(5):759-769

[5]Wang W Y,De Mejia E G.A new frontier in soy bioactive peptides that may prevent age-related chronic diseases[J].Compr Rev Food Sci F,2005,4(4):63-78

[6]Gonzales T,Robert-Baudouy J.Bacterial aminopeptidases:properties and functions[J].FEMS Microbiol Rev,1996,18(4):319-344

[7]Basten D E J W,Visser J,Schaap P J.Lysine aminopeptidase of Aspergillus niger[J].Microbiology-SGM,2001,147:2045-2050

[8]Jalving R,Godefrooij J,ter Veen W J,et al.Characterisation of the Aspergillus niger dapB gene,which encodes a novel fungal type IV dipeptidyl aminopeptidase[J].Mol Genet Genomics,2005,273(4):319-325

[9]Basten D E,Moers A P,Ooyen A J,et al.Characterisation of Aspergillus niger prolyl aminopeptidase[J].Mol Genet Genomics,2005,272(6):673-679

[10]Basten D E J W,Dekker P J T,Schaap P J.Aminopeptidase C of Aspergillus niger is a novel phenylalanine aminopeptidase[J].Appl Environ Microb,2003,69(2):1246-1250

[11]Pel H J,de Winde J H,Archer D B,et al.Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88[J].Nat Biotechnol,2007,25(2):221-231

[12]Wilk S,Wilk E,Magnusson R P.Purification,characterization,and cloning of a cytosolic aspartyl aminopeptidase[J].J Biol Chem,1998,273(26):15961-15970

[13]Yokoyama R,Kawasaki H,Hirano H.Identification of yeast aspartyl aminopeptidase gene by purifying and characterizing its product from yeast cells[J].FEBS J,2006,273(1):192-198

[14]Watanabe J,Tanaka H,Akagawa T,et al.Characterization of Aspergillus oryzae aspartyl aminopeptidase expressed in Escherichia coli[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(10):2557-2560

[15]诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业出版社,1994

[16]Zialor.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,5(1233):751-780

[17]Tamura K,Dudley J,Nei M,et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Mol Biol Evol,2007,24(8):1596-1599

[18]Vallee B L,Auld D S.Zinc coordination,function,and structure of zincenzymesandotherproteins[J].Biochemistry,1990,29(24):5647-5659

[19]Wilk S,Wilk E,Magnusson R P.Identification of histidine residues important in the catalysis and structure of aspartyl aminopeptidase[J].Arch Biochem Biophys,2002,407(2):176-183

[20]Chaikuad A,Pilka E S,De Riso A,et al.Structure of human aspartyl aminopeptidase complexed with substrate analogue:insight into catalytic mechanism,substrate specificity and M18 peptidase family[J].BMC Struct Biol,2012,12:14

[21]吴延涛,丁国伟,席宏星,等.耐热赖氨酸氨肽酶菌株筛选、鉴定及基因克隆[J].食品与生物技术学报,2014(8):821-826

Molecular Cloning and Biochemical Characterization of An Aspartyl Aminopeptidase from Aspergillus niger

QIAO Ya-li1，DONG Zi-xing1，2，*，SONG Peng1，LIU Xiao-guang1，2，LU Fu-ping1
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In the present study，using complementary DNA （cDNA）of Aspergillus niger CICIM F0510 as the template，a novel gene （vaap）encoding aspartyl aminopeptidase was amplified by PCR and then successfully expressed in Pichia pastoris GS115.At the shake-flask level，the aminopeptidase activity of recombinant strain GS115 （pPIC9K-vaap）was 39.7 U/mL.The optimum temperature and pH of recombinant enzyme Vaap were shown to be 55℃ and 9.5，respectively.After incubation at 90℃or pH 8.0-10.0 for 1 h，this enzyme retained 20%or 80%of its initial activity.The activity of Vaap was significantly enhanced by Sn2+and Co2+，but inhibited by Fe3+，Ca2+，EDTA and SDS.Its Kmand Vmaxvalues towards L-leucine-pnitroanilide （Leu-pNA）were determined to be 12.96 mmol/L and 2.14 μg/（mL·min），respectively.Among the eight substrates tested，LeupNA was the preferred substrate for Vaap，and it also hydrolyzed alanine-pnitroanilide（Ala-pNA·HCl）and Lysine-pnitroanilide（Lys-pNA·2HCl）.

aspartyl aminopeptidase；Aspergillus niger；molecular cloning；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.036

乔雅丽（1991—），女（汉），硕士，研究方向：酶工程与技术。

*通信作者：董自星，助理研究员，研究方向：酶工程与技术。

2017-05-12