石榴籽油总多酚含量测定方法的优化

申元福，赵琦，陈芳，谢贞建，周闯，姚倩，*

（1.成都大学四川抗菌素工业研究所，四川成都610106；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都610106）

石榴籽油总多酚含量测定方法的优化

申元福1，2，赵琦2，陈芳2，谢贞建2，周闯2，姚倩2，*

（1.成都大学四川抗菌素工业研究所，四川成都610106；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都610106）

对石榴籽油总多酚含量测定方法进行优化。考察提取溶剂、溶剂浓度和提取次数对石榴籽油总多酚提取效率的影响，同时以石榴籽中所含的3种多酚及油多酚提取液为研究对象，对测定方法的检测波长、Folin-Ciocalteu试剂用量、碳酸钠溶液用量、试剂加入的间隔时间和反应时间进行了优化。结果显示：石榴籽油经80%乙醇提取3次后多酚可提取完全，优于常用的甲醇提取或经正己烷脱脂处理后的甲醇提取法。以没食子酸为对照，优化后的显色条件为：检测波长765 nm，Folin试剂3.5 mL，7.5%的碳酸钠溶液2.5 mL，试剂加入间隔时间5 min，显色反应30 min。此条件下没食子酸的高、中、低浓度平均回收率为（100.69±0.34）%；没食子酸浓度在10 μg/mL～60 μg/mL范围内，吸光度与浓度线性关系良好（r=0.999 1）；同一样品重复测定6次的RSD为0.67%。

石榴籽油；多酚；提取；含量测定；显色条件

在日常生活中，食品的储存常常会加入化学合成抗氧化剂，但这类抗氧化剂的毒副作用较大[1]，因此选择天然抗氧化剂是研究的热点。植物多酚作为一种天然的抗氧化剂，是植物生长过程中体内多元酚类的次生代谢产物[2]。它是一类多羟基酚类化合物的总称，主要由酚酸、黄酮、单宁、原花色素等组成[3]。研究表明，植物多酚具有抗动脉硬化、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等多种药理作用[4-6]。

据文献报道[7-9]，一些植物油中也常常含有大量的多酚物质，例如石榴籽油、橄榄油、葡萄籽油。由于多酚的存在，起到了对油脂氧化变质的保护作用，多酚也是植物油质量评价的一项重要指标[10-11]。目前对于植物油中总多酚的测定，常用的方法有直接测定[12-13]或经甲醇溶液提取后，采用Folin-Ciocalteu分光光度法检测[14]；为进一步降低油中脂溶性成分对检测的干扰，有文献使用正己烷先行脱脂处理，再用甲醇提取[15-16]。检测方法的优化集中在对Folin试剂反应条件的改进上[17]。本文选择石榴籽油为研究对象，考察了石榴籽油多酚的提取条件，对多酚提取溶剂做了改进；针对常用的Folin试剂分光光度显色法，以油多酚提取液及石榴籽中所含的3种多酚为考察对象，采用单因素法对显色条件进行了优化，为植物油多酚含量的准确评价提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴籽油：西安普莱特生物工程有限公司；没食子酸：成都市科龙化工试剂厂，含量大于99.0%；儿茶素：深圳一诺食品配料有限公司，含量99.80%；咖啡酸：陕西森弗天然制品有限公司，含量99.0%；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；SF-TGL-16M离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；VORTEX-5旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Folin试剂分光光度法

1.3.1.1 Folin-Ciocalteu试剂的制备[18]

取100 g钨酸钠和25 g钼酸钠，溶解在800 mL水中，随后加入100 mL盐酸与50 mL磷酸，回流10 h，冷却后加入150 g硫酸锂，50 mL水，及4滴～6滴溴水，放置2 h，溶液煮沸15 min，冷却后滤过，溶液应无绿色。使用前用水稀释10倍。

1.3.1.2 样品溶液的制备

精确移取石榴籽油0.25 mL，分别加入0.5 mL乙醇溶液、甲醇溶液或先加入正己烷旋涡脱脂，再加入甲醇溶液，旋涡振荡提取其中的总多酚，在8 000 r/min转速下离心10 min，收集上清液，即得样品溶液。

1.3.1.3 对照品溶液的制备

精确称取没食子酸、儿茶素和咖啡酸对照品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得到浓度为1mg/mL的储备液。取没食子酸、儿茶素和咖啡酸的储备液，分别用甲醇稀释制成浓度为30、120、25 μg/mL的溶液。

1.3.1.4 测定方法[18]

分别取对照品溶液及样品溶液各0.5 mL，置试管中，加入2.5mL经稀释的Folin-Ciocalteu试剂，及2.0mL浓度为7.5%的碳酸钠溶液，加盖，旋涡混匀，25℃下放置30 min，在10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液，用紫外-可见分光光度计在760 nm波长处测定吸光度值A，根据标准曲线计算样品中总多酚的含量，以 μg没食子酸当量（Gallic acid equivalents，GAE）/mL，即μg GAE/mL表示。

1.3.2 总多酚提取条件的优化

1.3.2.1 提取溶剂的选择

精确移取石榴籽油0.25 mL，分别选择0.5 mL 80%乙醇和0.5 mL 80%甲醇提取3次，或先加入等体积正己烷脱脂，再使用0.5 mL 80%甲醇提取3次，合并提取液，按照“1.3.1.4”项下操作，测定总多酚的含量，确定提取溶剂。

1.3.2.2 提取溶剂浓度的选择

精确移取石榴籽油0.25 mL，将确定的溶剂浓度设定为75%、80%、85%，提取3次，每次0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”项下操作，测定总多酚的含量，确定提取溶剂浓度。

1.3.2.3 提取次数的选择

精确移取石榴籽油0.25 mL，根据确定的溶剂进行提取，提取次数设定为 2、3、4 次，每次 0.5 mL，合并提取液，按照“1.3.1.4”项下操作，测定总多酚的含量，确定提取次数。

1.3.3 总多酚测定条件的优化

1.3.3.1 检测波长的选择

分别移取0.5 mL 3个多酚对照品和石榴籽油多酚提取液，按照“1.3.1.4”项下操作，用紫外可见分光光度计在600 nm～850 nm波长范围内扫描，确定检测波长。

1.3.3.2 Folin试剂用量的选择

分别移取0.5 mL对照品和多酚提取溶液，分别加入 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL Folin 试剂，及 2.0 mL 浓度为7.5%Na2CO3溶液，旋涡混匀，25℃下放置30 min，用蒸馏水稀释至10 mL，在检测波长处测定吸光度，确定Folin试剂的用量。

1.3.3.3 Na2CO3溶液用量的选择

分别移取0.5 mL对照品和多酚提取溶液，加入选定用量的Folin试剂，再分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，其余操作同上，确定7.5%Na2CO3溶液的用量。

1.3.3.4 间隔时间的选择

分别移取0.5 mL对照品和多酚提取溶液，加入选定用量的 Folin 试剂，分别放置 0、3、5、10、15 min后，再加入选定用量的Na2CO3溶液，其余操作同上，确定试剂加入的间隔时间。

1.3.3.5 反应时间的选择

在确定的条件下，将反应时间设为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余操作同上，确定最佳反应时间。

1.3.4 测定方法的考察

以没食子酸为对照计算总多酚含量，对方法进行线性关系、准确性等考察。

1.3.4.1 线性关系

精确移取没食子酸储备液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，用甲醇稀释成浓度为 10、20、30、40、50、60μg/mL的溶液。按照“1.3.3”中优化的条件下操作，反应结束后，用蒸馏水定容至10 mL，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.2 回收率

精确移取3份多酚浓度已知的石榴籽油，分别加入没食子酸对照品 22.5、12.0、8.0 μg，用 0.5 mL 80%的乙醇提取3次，合并提取液，按优化后的显色条件试验，并推算出对照品含量，与实际加入量作比较，计算没食子酸高、中、低浓度的回收率。

1.3.4.3 重复性

精确移取 6份石榴籽油，按照“1.3.2”和“1.3.3”中优化的条件下操作，测定石榴籽油总多酚含量，考察测定方法的重复性。

1.3.4.4 稳定性

取石榴籽油提取液及浓度为30 μg/mL没食子酸对照品溶液，按照“1.3.3”中优化的条件下操作，避光放置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，测定吸光度，考察方法的稳定性。

1.3.5 样品的测定

取市售的3个不同厂家的石榴籽油，采用优化后的提取与显色条件测定油中的总多酚。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化结果

2.1.1 提取溶剂的选择

在试验过程中发现，用无水乙醇或纯甲醇提取时，提取液中含有较多的脂溶性成分，检测中加入碳酸钠溶液时易变浑浊，不利于多酚的测定；用低浓度的乙醇或甲醇溶液提取时，提取效果明显下降，使得提取次数增多，加大了溶剂的用量和操作时间。因此，试验考察了80%乙醇和80%甲醇两种溶剂对石榴籽油中多酚的提取效果，测得的多酚含量见图1。

图1 提取溶剂对总多酚含量测定的影响Fig.1 The effect of extraction solvent on the determination of total polyphenols

如图1所示，以80%乙醇溶液提取为最高，正己烷脱脂-80%甲醇提取的总多酚略高于甲醇，而脱脂后的样品仍然需经离心处理，否则溶液为混浊状态，不能用光度法检测。可见，正己烷脱脂对提高检测用样品澄清度无明显作用。

2.1.2 提取溶剂浓度的选择

考察75%、80%和85%3个乙醇浓度对石榴籽油中总多酚提取的影响。溶剂浓度对总多酚含量测定的影响见图2。

图2 溶剂浓度对总多酚含量测定的影响Fig.2 The effect of solvent concentration on the determination of total polyphenols

如图2所示，用80%乙醇的提取效果明显好于用75%乙醇提取；当乙醇体积分数为85%时，其提取能力比80%乙醇略高一点，但检测溶液的浊度明显增加，影响测定结果。因此，在提取效果相差不大时，宜选择含水量较大的溶剂提取，避免浑浊现象的发生。故选用80%乙醇提取。

2.1.3 提取次数的选择

提取次数对总多酚含量测定的影响见图3。

如图3所示，随着提取次数的增加，总多酚的含量也随之增加。在提取3次后，其总多酚含量的增加程度不明显。故选择提取次数为3次。

图3 提取次数对总多酚含量测定的影响Fig.3 The effect of extraction times on the determination of total polyphenols

2.2 总多酚测定条件的优化结果

2.2.1 检测波长的选择

样品和多酚溶液的波长扫描结果见图4。

图4 样品和多酚溶液的波长扫描结果Fig.4 Scanning spectrums of the sample and polyphenol solutions after reacting with Folin－Ciocalteu reagent

如图4所示，样品和3种多酚溶液均在765 nm处有最大吸收峰，故选765 nm作为检测波长。

2.2.2 Folin试剂用量的选择

Folin－Ciocalteu用量对总多酚含量测定的影响见图5。

图5 Folin－Ciocalteu用量对总多酚含量测定的影响Fig.5 The effect of Folin－Ciocalteu amount on the determination of total polyphenols

如图5所示，当Folin试剂用量为2.5 mL时，儿茶素和咖啡酸的反应体系中出现浑浊现象，导致测定结果偏高。3种多酚表现出了相同的趋势，即当试剂用量增加到3.5 mL时，其吸光度值达到最大，此时溶液为蓝色。继续增加Folin试剂体积，试剂本身的颜色将掩盖反应溶液的颜色，导致吸光度值下降。样品溶液的变化趋势与多酚对照品溶液有所不同，吸光度随Folin试剂用量的增加而增加，无下降的情况发生，当用量为3.5 mL时，其吸光度值达到拐点，此时再增加试剂体积，吸光度值增大不明显，说明Folin试剂与混合多酚及单一多酚的反应存在差异。因此Folin试剂的用量选择为3.5 mL。

2.2.3 Na2CO3用量的选择

7.5 %碳酸钠用量对总多酚含量测定的影响见图6。

图6 7.5%碳酸钠用量对总多酚含量测定的影响Fig.6 The effect of 7.5%of the sodium carbonate amount on the determination of total polyphenols

如图6所示，随着7.5%Na2CO3的用量增加，样品和3种多酚溶液的吸光度值也增加，当Na2CO3的用量为2.5 mL时，3种对照品溶液的吸光度值达到最大。样品溶液在Na2CO3的用量为2.0 mL时，其吸光度达到最大，继续增加Na2CO3的用量到2.5 mL，其吸光度值略有下降，但不明显。因此选择7.5%Na2CO3的用量为2.5 mL。

2.2.4 间隔时间的选择

间隔时间对总多酚含量测定的影响见图7。

如图7所示，随着Folin试剂与Na2CO3溶液加入间隔时间的延长，样品和3种多酚溶液的吸光度值增加，当间隔时间为5 min时，吸光度值达到平衡。因此试剂加入的间隔时间为5 min。

2.2.5 反应时间的选择

反应时间对总多酚含量测定的影响见如8。

如图8所示，样品、没食子酸的反应时间为30 min时，吸光度值达最大，继续增加反应时间，吸光度保持恒定；咖啡酸反应时间为1 h，儿茶素需经1.5 h的反应才可使吸光度值达到最大，继续延长反应时间，吸光度值开始下降。反应时间与酚羟基的位置与数量相关，没食子酸含3个相邻的酚羟基，反应速度相对较快；咖啡酸含2个相邻的酚羟基，反应时间延长；儿茶素有4个酚羟基，2个相邻，另2个处于间位，反应速度进一步减慢。若以没食子酸为对照计算样品中总多酚的含量，反应时间可控制在30 min。

图7 间隔时间对总多酚含量测定的影响Fig.7 The effect of interval time on the determination of total polyphenols

图8 反应时间对总多酚含量测定的影响Fig.8 The effect of reaction time on the determination of total polyphenol

2.3 方法学考察结果

2.3.1 线性范围

吸光度值与没食子酸浓度的回归方程：A=0.0077C+0.035 1（r=0.999 1）。可见，没食子酸在 10 μg/mL～60 μg/mL浓度范围内，与吸光度的线性关系良好。

2.3.2 回收率试验

回收率试验结果见表1。

表1 回收率试验结果Table 1 The results of recovery test

由表1可知，平均回收率为100.69%，RSD为0.34%，表明该方法的准确性较高。

2.3.3 重复性试验

同一批次石榴籽油重复测定6次，总多酚的平均含量为 188.28 μg GAE/mL，RSD 为 0.67%，RSD 小于1.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果Table 2 The result of stability test

由表2可知，样品溶液和浓度为30 μg/mL的没食子酸对照品溶液按照“1.3.3”中优化的条件试验，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，RSD均小于0.5%，表明该方法稳定。

2.4 样品的测定

以没食子酸为对照，采用所建立的方法分别测定了来自3个不同产地的石榴籽油中总多酚的含量，结果见表3。

表3 不同产地石榴籽油总多酚含量Table 3 Total polyphenols in pomegranate seed oils from different sources

3 结论

本文选择80%乙醇提取石榴籽油中的总多酚，并与文献报道的采用甲醇提取或先用正己烷对植物油进行脱脂处理，再加甲醇提取方法进行了比较，试验发现采用80%乙醇提取石榴籽油中总多酚，经3次提取后，总多酚提取效率为最高；此外，以石榴籽油多酚提取物和石榴籽中所含的3种多酚为考察对象，对Folin试剂分光光度显色条件进行了优化，优化后没食子酸平均回收率为（100.69±0.34）%。本法简便、准确、稳定，值得推广应用。

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Method Optimization for the Determination of Total Polyphenols in Pomegranate Seed Oil

SHEN Yuan-fu1，2，ZHAO Qi2，CHEN Fang2，XIE Zhen-jian2，ZHOU Chuang2，YAO Qian2，*
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.School of Pharmacy and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

The method for the determination of total polyphenols in pomegranate seed oil was optimized in this study.The effects of extraction solvents，solvent concentration and extraction times on the extract efficiency of total polyphenols from pomegranate seed oil were examined.Meanwhile，the assay conditions，including detection wavelength，the amounts of Folin-Ciocalteu reagent and sodium carbonate solution，the interval time for the reagent addition，and the reaction time，were screened for three polyphenols in pomegranate seeds and the phenol extract from the oil，respectively.The results showed that total polyphenols in the oil was recovered completely by being extracted with 80%ethanol for three times.The extract efficiency was higher than the commonly used methods，either extraction with methanol or being defatted with hexane followed by methanol extraction.Based on the control of gallic acid，the chromogenic conditions were optimized as followed：detection at 765 nm，3.5mLofFolin-Ciocalteureagent，2.5mLof7.5%sodiumcarbonatesolution，5minofintervaltimeforthereagent addition，30 min of reaction time at 25℃.Under such conditions，the mean recovery of gallic acid at low，medium，and high concentrations was（100.69±0.34）%.The absorbance was linear with the gallic acid concentration intherangeof10μg/mLto60μg/mL（r=0.9991）.TheRSDofsix-timeassaysforthesamesamplewas0.67%.

pomegranate seed oil；polyphenol；extract；determination；chromogenic conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.023

四川省教育厅重点项目（16ZA0390）；教育部留学回国人员科研启动基金（20131792）

申元福（1992—），男（汉），硕士研究生，研究方向：药食同源植物提取与产品开发。

*通信作者：姚倩（1971—），女（汉），教授，博士，研究方向：药食同源植物有效部位的筛选与产品开发。

2017-04-19