布鲁氏菌IV型分泌蛋白及其参与免疫应答的研究进展

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·综述·

布鲁氏菌IV型分泌蛋白及其参与免疫应答的研究进展

肖启程1，田一男1，彭广能1，李平2，魏斌1，涂蕊1，但佳明1，任志华1，钟志军1

布鲁氏菌是一种胞内致病菌，主要寄生于宿主的滋养层细胞和巨噬细胞，能感染人、家畜和野生动物。动物感染后引起母畜的流产和公畜的睾丸炎等症状，而人感染后则引起关节疼痛、乏力、发热及肝脾肿大等症状。布鲁氏菌在与宿主的对抗中依赖免疫逃避机制，帮助布鲁氏菌“伪装”起来逃避宿主免疫系统的识别，进而在细胞内大量繁殖，引起机体的持续感染。由于该机制的存在，使得目前对布鲁氏菌病的治疗存在诸多困难。IV型分泌系统(T4SS)是布鲁氏菌的一种关键毒力因子，其所分泌的效应蛋白帮助调节布鲁氏菌在胞内的生存以及感染时的免疫应答。本文中，我们对布鲁氏菌IV型分泌系统相关蛋白及其参与免疫应答的研究进行综述，尤其对VirB操纵子所介导的IV型分泌系统产生的分泌效应蛋白与宿主免疫之间的关系进行详细阐述。

布鲁氏菌；分泌蛋白；免疫应答

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种自然疫源性、人兽共患传染性疾病，临床症状主要表现为波浪热，可引发心包炎、脑膜炎，怀孕母畜出现流产，公畜出现睾丸炎等[1]。大多数病原菌会在先天免疫系统的监视下被阻止，与其他细菌感染相比较，动物感染布鲁氏菌后，可通过免疫逃避机制躲避宿主的识别，从而引起更低的免疫反应[2]。研究表明体液免疫应答在免疫后期下降的情况下，疫苗的免疫保护力仍然保持恒定不变[3]，表明细胞免疫是布鲁氏菌免疫应答的主要方式。Mariana X Byndloss等[4]研究发现，流产布鲁氏菌感染胚胎滋养层细胞时，IV型分泌系统(T4SS)的调理作用引起滋养层细胞发生非折叠蛋白应答，导致调节内质网反应的细胞死亡并释放损伤相关分子模式，使吞噬细胞聚集在细胞周围并释放流产布鲁氏菌。表明非折叠蛋白应答与布鲁氏菌在宿主细胞内生存存在密切联系。

布鲁氏菌感染宿主细胞经历以下阶段： 1)布鲁氏菌首先侵入宿主细胞中形成布氏小体； 2)晚期胞内体和溶酶体与布氏小体的融合受布鲁氏菌的抑制，其中约10%的布氏小体未被降解得以存活； 3)未降解的布氏小体经转运到达内质网并建立复制点进行复制； 4)布鲁氏菌在内质网复制结束后，形成自体吞噬泡最终脱离宿主细胞进而到达其他细胞而持续感染传播。研究表明，布鲁氏菌在宿主细胞复制过程中，T4SS在晚期胞内体与溶菌酶的标记，识别内质网标记并作用于分泌途径，识别自噬体的标记，抵御苛刻的胞内环境和调控免疫途径的激活等一系列过程中发挥重要作用[2]。因此对T4SS进行研究对于理解布鲁氏菌的感染有重要意义。

1 布鲁氏菌IV型分泌系统与VirB操纵子

布鲁氏菌的IV型分泌系统是II型染色体中的12个基因在细菌细胞膜上组成(VirB1-12)的多蛋白复合物，通过VirB操纵子编码，参与布鲁氏菌的胞内活动。一旦细菌的T4SS组装完成，布鲁氏菌就可以通过该系统分泌效应蛋白感染宿主细胞。布鲁氏菌T4SS与其他细菌T4SS的组分相似，比如农杆菌和百日咳杆菌[5]。T4SS系统主要分为以下5部分：1)由VirB2组成的伸长区；2)由VirB7、VirB9和VirB10组成的中心区和外膜区；3)由VirB5和VirB10的片段组成连接区；4)由VirB3、VirB4、VirB6、VirB8和VirB10的N端组成的内膜区；5)由VirB4和VirB11组成的ATP酶能量区[2]。VirB作为布鲁氏菌的毒力基因，它在宿主细胞的表达可影响布鲁氏菌的胞内生存与复制[6]。VirB操纵子的12种基因所具有的功能不尽相同，目前关于12个VirB基因对布鲁氏菌毒力的影响，主要集中在对牛种、羊种、猪种和绵羊附睾种布鲁氏菌的研究(表1)。表1显示了每个基因缺失后对牛种、羊种、猪种和绵羊附睾种布鲁氏菌毒力的影响。VirB最初在猪种布鲁氏菌中首次被发现，随后在所有布鲁氏菌种中都发现了高度保守的VirB基因序列，表明了该操纵子在布鲁氏菌中有着重要的作用[7]。研究表明，牛种布鲁氏菌VirB1突变体在人的宫颈癌细胞中不能复制，论证了VirB操纵子影响牛种布鲁氏菌的胞内生存[8]。另一研究表明，牛种布鲁氏菌VirB1突变株在小鼠巨噬细胞中生存能力也降低，进一步表明VirB1缺失后布鲁氏菌的毒力受到抑制[9]。Andreas B. den Hartigh等[9]研究表明，牛种布鲁氏菌VirB1突变株在巨噬细胞中的生存能力下降，而牛种布鲁氏菌VirB2基因突变株在巨噬细胞和小鼠器官中的生存能力都下降，但VirB12对牛种布鲁氏菌的毒力无影响。Yao-Hui Sun等[10]研究表明VirB12对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌的毒力同样也无影响。Joicy C. Sa等[11]研究表明，绵羊附睾种布鲁氏菌可以在脾脏中繁殖，而其VirB2突变株不能在巨噬细胞中生存和繁殖，证明了VirB2的缺失同样使绵羊附睾种布鲁氏菌的毒力减弱。R.-M. Delrue等[12]采样免疫荧光法检测羊种布鲁氏菌16M菌株VirB2、VirB4和VirB9突变体在人宫颈癌细胞内的生存能力，结果表明，3种VirB突变体在人宫颈癌细胞的生存能力都明显低于羊种布鲁氏菌16M菌株。Nicolas Sprynski等[13]构建了猪种布鲁氏菌VirB5突变株，巨噬细胞试验表明，缺失VirB5降低了猪种布鲁氏菌的毒力。David等[7]对VirB5和VirB9进行突变，巨噬细胞试验显示，猪种布鲁氏菌VirB5和VirB9突变体的感染能力明显下降，表明猪种布鲁氏菌VirB5和VirB9突变株的毒力也受到影响。牛种布鲁氏菌的VirB3～VirB11缺失突变株在小鼠巨噬细胞中的生存能力都有所下降，可能是由于VirB操纵子缺失所致，表明VirB操纵子对布鲁氏菌的胞内生存具有重要作用。以上试验都表明，T4SS可以调节布鲁氏菌的胞内生存能力。同时有研究表明，T4SS参与引起细菌的炎症反应和影响宿主感染时的免疫应答。试验表明，在细菌中突变T4SS后，野生型菌株可以在宿主内引起比突变株更强的免疫应答反应，因此可推论T4SS对抑制宿主的免疫应答起重要作用[14-15]。在人的宫颈癌细胞和外周血单核细胞(THP1)培养布鲁氏菌T4SS突变体试验中，通过对布鲁氏菌突变体在细胞内增殖能力的检测，发现破坏T4SS能阻止布鲁氏菌在细胞内的生存[12,16]，从而论证了T4SS对布鲁氏菌胞内存活的重要性。

不同细菌T4SS的组成较保守，但也存在一定的差异。布鲁氏菌T4SS的结构没有完全一致性，多数特征与农杆菌属和幽门螺杆菌的T4SS结构相似。胞质和内膜是由VirB6和VirB8与ATP酶VirB4，VirB11和VirD4而组成。VirB7、VirB9和VirB10相互作用形成一个可跨越内膜和外膜的T4SS复合体核心。VirB2和VirB5能组成纤毛。VirB3可能与纤毛的形成有关。而农杆菌属VirB1属于一肽聚糖降解的转糖激酶，可以调节周质的分泌系统[17]。研究报道，对幽门螺杆菌的Virb11同系物进行分析，结果表明该同系物是一种具有紧密、均匀对称的动态蛋白质。而当组成virB11同系物的核苷酸结合时可以调节空间结构使T4SS进行组装。虽然幽门螺杆菌和VirB10同系物都有中央鞘包裹，但是大多数T4SS的修饰物质是VirB5。农杆菌属VirB5以那些短小、无结构的羧基端蛋白质为目标对纤毛进行修饰。VirB5出现在细菌表面，表明它可能与宿主蛋白发生反应[18]。

农杆菌属和布鲁氏菌T4SS间最重要的差异是后者VirB操纵子中存在一个额外的基因VirB12，可编码一个外膜脂蛋白，同时布鲁氏菌T4SS缺乏一个编码VirD4耦合蛋白同系物的基因。VirD4耦合蛋白在T4SS发挥功能中扮演了重要的角色，即为转运招募蛋白质底物。如农杆菌属利用双分子荧光互补技术和免疫荧光显微技术证明了VirD4与VirE2效应子蛋白之间的两极定位与相互作用[18]。

表1 VirB操纵子的12个基因及其在牛种、羊种、猪种及绵羊附睾种布鲁氏菌中的作用
Tab.1 The 12 genes of VirB operon and their respective function in B. abortus, B. melitensis, B. suis and B. ovis

操纵子Operon缺失后毒力是否减弱Whetherornotthevirulencedecreasesafterdeletion牛种布鲁氏菌羊种布鲁氏菌猪种布鲁氏菌绵羊附睾种布鲁氏菌功能FunctionVirB1是未知未知未知溶解糖基转移酶，从而使T4SS更易装配和集合[19]VirB2是是未知是参与机体的免疫保护作用，影响免疫保护力的产生[20]VirB3是未知未知未知细菌跨膜蛋白信号的传送[21]VirB4是是未知未知运输物质，可有效阻止布氏小体与溶酶体融合VirB5是未知是未知调节布鲁氏菌的胞内运输和吞噬[22]VirB6是未知未知未知细菌跨膜蛋白信号的传送VirB7是未知未知未知细菌跨膜蛋白信号的传送VirB8是未知未知未知调节布鲁氏菌的胞内运输和吞噬VirB9是是未知未知作为布鲁氏菌IV型分泌系统细菌外膜的组成部分，可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应[23]VirB10是未知未知未知细菌跨膜蛋白信号的传送VirB11是未知未知未知为布鲁氏菌的分泌过程提供能量[24]VirB12无影响未知免疫性抗原[25]

2 目前已发现的效应蛋白

目前，我们对布鲁氏菌T4SS的效应蛋白了解的还比较少，仅有部分效应蛋白的功能得到初步鉴定。表2中为目前在布鲁氏菌T4SS中发现的15种效应蛋白。

2.1效应蛋白VceA和VceC 在T4SS分泌的效应蛋白质中，VirB调控的效应物A(VceA)和效应物C(VceC)是研究人员最早识别的两个T4SS效应蛋白。通过半乳糖苷酶结合和β-半乳糖苷酶活性检测显示，在流产布鲁氏菌VjbR突变体中，VceC和VirB的表达下调，表明它们受相同转录因子的调控[26]。VceC的C端含20种氨基酸，包含T4SS进行转运识别的序列，主要参与VceC转移到宿主细胞过程中；N端是由38种氨基酸形成的疏水跨膜区，主要与VceC的定位和干扰内质网的作用有关[26-27]。免疫共沉淀结果显示，内质网的分子伴侣蛋白Bip/Grp78可以结合到VceC脯氨酸含量高的区域[27]，此区域为VceC的特征域。与VceC的定位和对其有相互作用的宿主细胞进行识别相一致，VceC可激活非折叠蛋白应答，引起内质网进行蛋白质的折叠和修饰，同时还能在感染期间诱导脯氨酸的炎性反应。

2.2效应蛋白RicA RicA是IV型分泌系统分泌的重要蛋白之一,主要参与布鲁氏菌的胞内运输[28]。RicA不仅可以与小GTP结合蛋白Rab2相互作用，还与蛋白质的折叠有关[29]。此外，Xavier de Bolle等发现Rab2与布鲁氏菌RicA蛋白相互作用可以调控布氏小体的成熟，从而间接影响牛种布鲁氏菌和宿主细胞的活动。布鲁氏菌RicA的抗原决定簇较多，主要存在于N端，且试验结果表明该蛋白具有较强的免疫原性，因此宿主细胞会产生相应的免疫反应[26]。研究发现RicA的晶体结构和γ-碳酸酐酶类蛋白质的结构高度相似，这些蛋白质都含有锌离子，但却没有碳酸酐酶的作用，说明RicA有一种尚未清楚的独特功能[30]。RicA可以与机体内、外游离的鸟苷二磷酸(GDP)与结合GDP反应形成Rab2，但不能与结合GTP反应，说明RicA并不是一种激活GTP酶的蛋白质[30-31]。进一步的试验表明，RicA不是Rab2的鸟嘌呤核苷酸的交换因子，因此它无法激活GTP酶。RicA缺失突变株在小鼠细胞和人宫颈癌细胞中毒力并未减弱，而且其细胞内化和胞内生存能力也没有变化，但与野生型布鲁氏菌相比,RicA突变株消耗了宿主细胞内大量的溶酶体相关膜蛋白LAMP1，表明RicA缺失突变株可以逃离晚期胞内体到达内质网并迅速建立复制点[31]。有研究表明，在牛种布鲁氏菌感染过程中，布鲁氏菌会将RicA蛋白转运至巨噬细胞中，但RicA并不能在VirB缺失株感染细胞时进行转运，而且经检测在VirB缺失株的培养基中也发现了RicA。说明RicA是依赖于VirB的存在进行转运，但其分泌却不受VirB的影响[31]。

2.3效应蛋白BtpA和BtpB BtpA和BtpB是T4SS分泌的产生毒力的必要蛋白质，能抑制树突细胞的成熟，但是它们在活化NF-kB时却有着截然相反的作用，BtpA有抑制作用而BtpB则引起NF-kB的活化[32]。它们在哺乳动物中存在一个保守的TIR区域，负责在先天免疫识别过程中调节信号级联放大效应[33]。这两种蛋白通过CyaA试验确认可以转运到宿主细胞中，但TEM-1内酰胺酶的试验中发现BtpB的转运效率明显低于其他效应蛋白质。为了调节宿主细胞Toll样受体信号通路，细菌可以将BtpA转运至细胞，而存在于细胞中的T4SS很可能是实现这种转运最有效的机制之一。此外，BtpA和BtpB属于同一类细菌蛋白质。它们都具有Toll受体结构域，Toll样受体结构域存在于真核生物的Toll样蛋白及其下游的Toll样衔接蛋白，当这二者相互作用时会产生级联信号引起核转录因子kB的核移位、促炎性细胞因子和I型干扰素的产生[34]。

2.4其他效应蛋白 BspC，BspE，BPE123, BPE005，BPE275和BPE043是另一部分由T4SS分泌的效应蛋白，具有高度的保守性,但目前对它们作用机制与功能的研究知之甚少。有研究表明，BspC和BspE存在于细胞核周围，其中BspC存在于高尔基体，BspE则会形成囊泡[35]。BspC的N端有依赖于Sec的信号肽，在不影响蛋白质分泌的情况下能引起内质网的应激反应。BPE005，BPE275和BPE043发现于其他细菌，而BPE123只存在于几种细菌中，包括杆菌状巴尔通体，苍白杆菌等[36]。BPE123是B型流产布鲁氏菌通过VirB转运的一种效应蛋白。María I. Marchesin等通过液相串联质谱(LC/MS-MS)鉴别出了人的α-烯醇酶并用免疫共沉淀证明其可以与BPE123相互作用。α-烯醇酶的降解能阻碍牛种布鲁氏菌在人宫颈癌细胞中的增殖，表明α-烯醇酶在布鲁氏菌感染细胞的过程中起作用[37]。此外，BPE123和α-烯醇酶可以在布鲁氏菌的胞内生存阶段相互作用，且α-烯醇酶的活性很大程度上取决于BPE123的空间结构[37]。由此可推测，BPE123和宿主细胞α-烯醇酶相互作用有利于牛种布鲁氏菌的胞内生存。布鲁氏菌感染期间，BPE123存在于布氏小体的表面，它的N端含有25个氨基酸，可能是一种将其自身转运至宿主细胞的信号肽。在几种类型的细胞和小鼠模型中都发现BPE123缺失株和野生菌株的增殖能力并没有明显变化[36]。

表2 布鲁氏菌T4SS分泌的15种效应蛋白
Tab.2 The 15 effectors secreted by Brucella through T4SS

效应蛋白Effectproteins氨基酸数目No．ofaminoacids保守区Conserveddomains宿主中的靶位点Targetswithinhosts功能FunctionsVceA105无未知未知VceC418脯氨酸含量高的区域Bip/Grp78激活非折叠蛋白应答；诱导脯氨酸的炎性反应RicA175碳酸酐酶区域Rab2调控囊泡的转运；引起宿主细胞产生免疫反应BtpA250Toll样受体结构域未知抑制Toll样受体信号通路BtpB292Toll样受体结构域未知抑制Toll样受体信号通路BspA191DUF2062区未知抑制宿主细胞分泌蛋白质BspB187蛋白质结构分类结构域未知抑制宿主细胞分泌蛋白质BspF428GNAT家族的乙酰转移酶区未知抑制宿主细胞分泌蛋白质SepA130无未知抑制布氏小体与溶酶体的融合BspC137预测的依赖于Sec的信号肽区域未知未知BspE117卷曲螺旋区和TM区未知未知BPE123153载脂蛋白区未知未知BPE005153卷曲螺旋区未知未知BPE275253类Rhomboid区未知未知BPE0431553环核苷酸区未知未知

3 部分效应蛋白参与的免疫应答反应

VceC是布鲁氏菌IV型分泌系统分泌的重要效应蛋白之一，可通过T4SS进入到宿主细胞内发挥作用。但是VceC在宿主细胞内参与免疫应答的机制尚未清楚。张沾等[9]通过对VceC功能的初步研究，发现VceC能够使细胞分泌NO，NO再与O2-形成活性氮对蛋白进行修饰，造成免疫细胞的毒性反应。由此可推知，VceC可能引起了免疫细胞产生毒性反应，进而使宿主的免疫作用降低或丧失。

RicA的存在对布鲁氏菌的增殖有阻碍作用，可参与布鲁氏菌的胞内运输过程，但其他作用还有待研究。韩玉霞等[28]通过免疫印迹试验证明了RicA的免疫原性很强。这也就不难理解RicA的免疫原性增强，导致宿主产生大量的抗体或引起致敏T淋巴细胞介导的特异性免疫反应进而干扰布鲁氏菌的胞内生存。

目前，很多细菌都存在含有TIR域的蛋白质，比如大肠杆菌中的TcpC，沙门氏菌中的TlpA，这些蛋白具有抑制toll样受体信号通路的作用[38-44]。研究表明，Btp1含有TIR域,且可以干扰人先天性免疫相关蛋白TLR-2和TLR-4信号通路，从而抑制树突状细胞的成熟。当敲除Btp1后树突状细胞表面的MHCII和CD80的表达会升高，进而布鲁氏菌的免疫逃避受到破坏[32,45]，提示TIR域在布鲁氏菌的免疫逃避中发挥了重要作用。

此外，孙志华等[46]构建了BPE123的原核表达载体，并检测出BPE123具有免疫原性，表明BPE123可刺激机体产生抗体或进行细胞免疫。刘来珍等[47]构建了BMEI1069的原核表达载体，Western-blot检测出其具有免疫原性，同时还发现IL-1、IL-10和TNF-α的含量在加入BMEI1069蛋白后均升高，而当细菌在感染期中存在较高水平的复制时会引起TNF-α的含量减少，表明BMEI1069可能在细菌感染后期行使功能。Zhan Y等[48]研究发现，布鲁氏菌病的发生与小鼠体内的TNF-α被抑制有关，而BEMI1069引起了TNF-α含量升高会抑制布鲁氏菌内吞小泡的形成，布鲁氏菌受到溶菌酶和核内体的杀伤后会阻碍其感染宿主细胞，表明BEMI1069可以干扰布鲁氏菌对宿主细胞的侵入。

4 展 望

目前，我们对布鲁氏菌T4SS效应蛋白发挥的免疫作用了解得比较少，因此对布鲁氏菌效应蛋白功能的鉴定有利于阐明T4SS的功能和作用机制。迄今为止，已鉴定的布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白有15种，其中大多数效应蛋白在布鲁氏菌的致病机制尚不清楚。不同细菌T4SS分泌的效应蛋白虽然序列相似，但其结构、功能和作用机制、致病机理却不尽相同。布鲁氏菌是一种典型的胞内致病菌，研究布鲁氏菌T4SS的作用机制和其效应蛋白有助于阐明胞内菌的致病机理。

和其他细菌相比，目前对布鲁氏菌T4SS以及其效应蛋白的研究仍相对较少。根据目前的研究结果，未来以下研究可能是今后研究布鲁氏菌IV型分泌系统以及相关分泌蛋白的重点方向： 1)对效应蛋白的生化特性研究，包括定位其在宿主细胞的靶标部位以及与靶部位间作用的生化机制。研究效应蛋白是否具有特征性的结构域以及是否具有相关酶的活性，如激酶或磷酸酶活性等； 2)效应蛋白的细胞生物学特性研究，包括他们对细菌在胞内持续生存、细胞膜之间的对接、与宿主间的相关信号通路以及对布鲁氏菌内吞小泡转运的调控等； 3)阐明效应蛋白对布鲁氏菌在宿主体内毒力的影响，包括他们的必要性，在慢性感染中所扮演的角色，引起的炎症反应及这些效应物是否能解释布鲁氏菌典型的胞内生存方式等。研究这些效应蛋白不仅有利于我们了解细菌的致病机理，而且对研究真核生物宿主细胞的免疫应答反应极为重要。由于缺乏适当的免疫应答反应，宿主细胞无法抑制布鲁氏菌的感染[49-50]。因此，研究布鲁氏菌的效应蛋白将有助于我们理解胞内细菌抑制宿主免疫系统信号通路的机制。认清这些机制才能帮助科研人员进一步改进布病的治疗方法以及为今后疫苗研制提供理论依据。

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ResearchadvanceonBrucellaIVsecretionsystemproteinsanditsimmuneresponse

XIAO Qi-cheng1, TIAN Yi-nan1, PENG Guang-neng1, LI Ping2, WEI Bin1, TU Rui1, DAN Jia-ming1, REN Zhi-hua1, ZHONG Zhi-jun1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2.QionglaiAgricultureandForestryBureau,Qionglai611530,China)

Brucellais a facultative intracellular pathogen that causes infection in domestic animal and humans, mainly parasitizing in cells and macrophages of hosts.Brucellacan lead to abortion and sterility in animals. Meanwhile, it also causes arthralgia, weakness, undulat fever, hepatosplenomegaly and other symptoms in humans.Brucellarelies on immune escape mechanism in the confrontation with the host. It can helpBrucella"camouflage" to evade the identification of the immune system of the hosts and replicate within cells to persist to establish a long-term infection in the host. As a result of the existence of this mechanism, the treatment ofBrucellainfection is quite difficult. Type IV secretion system (T4SS) is a key virulence factor and it is essential forBrucellato survive in host cells. The effector proteins secreted by T4SS can help regulate the immune response againstBrucella. In this article, we reviewed the studies on related proteins of the type IV secretion system ofBrucellaand its immune response, especially the relationship between the secretions of effector proteins mediated by VirB operon and immunity of the host.

Brucella; secretory protein; immune response

Zhong Zhi-jun, Email: zhongzhijun488@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.015

国家重点研发计划(No.2016YFD0501009)；国家自然科学基金资助项目(No.31000548)；成都大熊猫繁育研究基金会项目(No.CPF2015-4)联合资助

钟志军，Email:zhongzhijun488@126.com

1.四川农业大学动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都 611130；

2.邛崃市农业和林业局，邛崃 611530

R378.5

A

1002-2694(2017)11-1029-07

Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0501009), the National Natural Science Foundation of China (No. 31000548) and the Chengdu Giant Panda Breeding Research Foundation (No. CPF2015-4)

2017-02-28编辑王晓欢