血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化与血清CEA及CA19-9在结直肠癌辅助诊断中的价值

刘伟，付波，张安琪，刘义华，卢燕，张姗，唐文强，潘丽

(聊城市人民医院，山东聊城252000)

血浆循环肿瘤DNA SEPT9基因甲基化与血清CEA及CA19-9在结直肠癌辅助诊断中的价值

刘伟，付波，张安琪，刘义华，卢燕，张姗，唐文强，潘丽

(聊城市人民医院，山东聊城252000)

目的比较SEPT9基因甲基化(mSEPT9)与癌胚抗原(CEA)及糖类抗原19-9(CA19-9)在结直肠癌(CRC)辅助诊断中的价值。方法收集CRC 35例(CRC组)、结肠直肠腺瘤65例(腺瘤组)和健康对照人群104例(对照组)的外周血样本，通过Real-time PCR法检测血浆mSEPT9状态，通过化学发光法检测血清CEA和CA19-9。结果CRC组、腺瘤组、对照组血浆mSEPT9阳性率分别为74.29%(26/35)、12.31%(8/65)、1.92%(2/104)，组间比较差异有统计学意义(P均lt;0.001)。CRC组、腺瘤组、对照组血清CEA阳性率分别为34.29%(12/35)、3.18%(2/63)、1.92%(2/104)，组间比较差异有统计学意义(P均lt;0.001)。CRC组、腺瘤组、对照组血清CA19-9阳性率分别为17.14%(6/35)、0(0/62)、0.96%(1/104)，组间比较差异有统计学意义(P均lt;0.001)。在不同TNM分期的CRC患者中mSEPT9阳性率：Ⅰ期60.0%(3/5),Ⅱ期62.5%(5/8),Ⅲ期77.78%(7/9),Ⅳ期84.62%(11/13);CEA阳性率：Ⅰ期0(0/5),Ⅱ期25%(2/8),Ⅲ期22.2%(2/9),Ⅳ期61.54%(8/13)；CA19-9阳性率：Ⅰ期0(0/5),Ⅱ期12.5%(1/8),Ⅲ期11.1%(1/9),Ⅳ期30.77%(4/13)。CRC中mSEPT9的灵敏度和特异度分别为74.29%和94.08%，高于CEA及CA19-9单独检测(分别为34.29%和17.14%)或二者联合检测(37.14%)的灵敏度，差异有统计学意义(P均lt;0.01)。mSEPT9在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中的阳性率达61.54%，高于CEA及CA19-9的阳性率(分别为15.38%和7.69%)，差异有统计学意义(Plt;0.05)。在CRC中mSEPT9与CEA联合的灵敏度为80%，与CA19-9联合的灵敏度为77.14%，三者联合的灵敏度为80%，与mSEPT9单独应用相比均不能显著提高CRC辅助诊断的灵敏度(P均gt;0.05)。结论mSEPT9与CEA和CA19-9相比，在CRC辅助诊断中具有更高的灵敏度，可作为独立的分子标志物，且可用于CRC早期诊断。

结直肠癌；SEPT9基因甲基化；癌胚抗原；糖类抗原19-9

结直肠癌(CRC)是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率居恶性肿瘤的第3～4位[1,2],近年发病率呈上升且年轻化趋势。目前国内CRC筛查诊断主要有两种方法：粪便隐血检测(FOBT)和结肠镜检查。FOBT具有简便、无创、经济、耐受性好等优势，但假阳性率较高[3]。全结肠镜检查或乙状结肠镜检查是CRC诊断的金标准，灵敏度及特异度高，但患者依从性差，存在肠道出血及感染风险，左右半肠结果差异明显[4]。肿瘤细胞生物化学的改变可反映其与正常细胞生长、增殖、代谢功能的差异，对肿瘤的诊断、鉴别诊断和预后判断有重要意义。癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)等血清学标志物在CRC辅助诊断及预后评估中有重要价值[5]。新近研究发现在CRC发生发展过程中SEPT9基因5′端CpG岛常发生甲基化，导致相应SEPT9基因表达降低，Septin蛋白复合物结构失去稳定，从而扰乱细胞分裂过程，导致细胞朝癌变方向发展[6]。血浆游离DNA中SEPT9基因甲基化(mSEPT9)可作为CRC敏感特异的分子标志物[7]。但mSEPT9与CEA、CA19-9在CRC辅助诊断中的价值比较鲜见报道。2016年8月，我们比较了血浆mSEPT9单独及与血清CEA及CA19-9联合在CRC辅助诊断中的价值。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 聊城市人民医院2015年8月～2016年7月经组织病理确诊的CRC患者35例(CRC组)，男20例、女15例，年龄(64.9±8.83)岁。肿瘤部位：结肠11例，直肠24例。CRC分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期8例，Ⅲ期9例，Ⅳ期13例。CRC组织分化程度：低分化腺癌14例，中分化腺癌17例，高分化腺癌4例。结直肠腺瘤65例(腺瘤组)，男42例、女23例，年龄(63.7±11.28)岁。肿瘤部位：结肠52例，直肠13例。均为低危腺瘤。健康对照人群104例(对照组)，男57例、女47例，年龄(62.4±7.39)岁。排除标准包括既往恶性肿瘤史；既往腹部手术史；接受放疗或化疗患者；妊娠期妇女。三组年龄、性别无统计学差异(P均gt; 0.05)。本研究通过聊城市人民医院伦理委员会批准。

1.2 血浆mSEPT9及血清CEA、CA19-9检测方法 血浆mSEPT9检测：利用Epi proColon 2.0 CE试剂盒，采用磁珠法提取血浆游离DNA(cfDNA)，通过Real-time PCR法检测mSEPT9。主要实验步骤：采集10 mL静脉血，(1 350±150)rcf离心12 min。再次离心后转移3.5 mL的血浆至一新的离心管中。加入100 μL磁珠，室温中速旋转混匀45 min。弃上清，转移磁珠至2 mL Eppendorf管。磁珠吸附后，吸弃上清，洗脱DNA。加入150 μL亚硫酸盐溶液80 ℃恒温孵育45 min转化DNA。加入磁珠结合后，洗涤磁珠，干燥后洗脱DNA。PCR反应体系：15 μL PCR预反应液加入15 μL经亚硫酸盐转化的DNA样本，进行三重平行PCR测试。PCR扩增条件：94 ℃预变性20 min；93 ℃变性30 s，62 ℃退火5 s，55.5 ℃延伸35 s，45个循环。PCR结果判读：三个平行测试中，两个及以上mSEPT9 Ct值lt;45结果判定为阳性，反之阴性。血清CEA、CA19-9浓度检测：利用Beckman DXI800全自动化学发光仪测定血清样本中CEA和CA19-9浓度。CEA的截断值为5 mg/L，CA19-9截断值为39 kU/L。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。定量资料比较采用t检验或单因素方差分析，率的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，基于确切的二项分布计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值的95%可信区间(95%CI)。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血浆mSEPT9及血清CEA、CA19-9阳性率比较 CRC组、腺瘤组、对照组血浆mSEPT9阳性率分别为74.29%(26/35)、12.31%(8/65)、1.92%(2/104)，组间比较差异有统计学意义(χ2=96.23，P均lt;0.001)。CRC组、腺瘤组、对照组血清CEA水平分别为(56.540±204.723)、(2.209±3.150)、(1.945±1.248)mg/L，组间比较差异有统计学意义(F=5.997，P=0.003)。按照CEA截断值5 mg/L标准，CRC组、腺瘤组、对照组血清CEA阳性率分别为34.29%(12/35)、3.18%(2/63)、1.92%(2/104)，组间比较差异有统计学意义(P均lt;0.001)。CRC组、腺瘤组、对照组血清CA19-9水平分别为(128.926±457.903)、(9.094±6.651)、(10.565±7.211)kU/L，组间比较差异有统计学意义(F=5.671，P=0.004)。按照CA19-9截断值39 kU/L标准，CRC组、腺瘤组、对照组血清CA19-9阳性率分别为17.14%(6/35)、0(0/62)、0.96%(1/104)，组间比较差异有统计学意义(P均lt;0.001)。在不同分期的CRC患者中mSEPT9阳性率：Ⅰ期60.0%(3/5)，Ⅱ期62.5%(5/8)，Ⅲ期77.78%(7/9)，Ⅳ期84.62%(11/13)；CEA阳性率：Ⅰ期0(0/5)，Ⅱ期25%(2/8)，Ⅲ期22.2%(2/9)，Ⅳ期61.54%(8/13)；CA19-9阳性率：Ⅰ期0(0/5)，Ⅱ期12.5%(1/8)，Ⅲ期11.1%(1/9)，Ⅳ期30.77%(4/13)。

2.2 血浆mSEPT9、血清CEA和CA19-9单独及联合在CRC辅助诊断中的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值比较 CEA在CRC诊断中的灵敏度低于mSEPT9，差异有统计学意义(χ2=11.283，P=0.002)。CA19-9在CRC诊断中的灵敏度低于mSEPT9，差异有统计学意义(χ2=23.03，Plt;0.001)。在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中mSEPT9的灵敏度为61.54%(95%CI：35.52%～82.29%)，CEA的灵敏度为15.38%(95%CI：4.33%～42.24%)，CA19-9的灵敏度为7.69%(95%CI：1.37%～33.31%)，差异有统计学意义(P=0.011)。在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)CRC中mSEPT9的灵敏度为81.81%(95%CI：61.48%～92.69%)，CEA的灵敏度为45.45%(95%CI：26.92%～65.34%)，CA19-9的灵敏度为22.73%(95%CI：10.12%～43.44%)，差异有统计学意义(χ2=15.636，Plt;0.001)。CEA和CA19-9联合检测在CRC诊断中的灵敏度为37.14%(95%CI：23.17%～53.66%)，低于mSEPT9单独检测的灵敏度，差异有统计学意义(χ2=9.785，P=0.002)。CEA和mSEPT9联合检测在CRC中的灵敏度为80%(95%CI：64.11%～89.96%)，与单独mSEPT9检测相比差异无统计学意义(χ2=0.324，P=0.777)。CA19-9和mSEPT9联合检测在CRC中的灵敏度为77.14%(95%CI：60.98%～87.93%)，与单独mSEPT9检测差异无统计学意义(χ2=0.078，P=1)。CEA、CA19-9和mSEPT9联合检测在CRC中的灵敏度为80%(95%CI：64.11%～89.96%)，与单独mSEPT9检测差异无统计学意义(χ2=0.324，P=0.777)。见表1。

3 讨论

CRC早期症状不典型，早期诊断率仅为5%，60%～70%的CRC患者确诊时已进展为中晚期[8]，病死率高，预后差，因此有效的早期筛查、诊断及干预治疗是CRC防治的关键。

表1 血浆mSEPT9、血清CEA和CA19-9单独及联合检测在CRC辅助诊断中的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值比较(%)

现有研究报道证实，血浆mSEPT9在CRC辅助诊断中具有良好的灵敏度(56.1%～79.3%)和特异度(89.6%～99.1%)[7，9，10]。本研究中血浆mSEPT9用于CRC诊断灵敏度和特异度分别为74.29%和94.08%，与文献报道一致。胃肠道血清学肿瘤标志物如CEA、CA19-9等已用于CRC的筛查、辅助诊断、肿瘤分级等，但这些指标在CRC诊断中敏感性较低[11]。CEA在CRC诊断中的灵敏度为40.9%～51.8%，特异度为85.2%～95%[12,13]。CA19-9在CRC辅助诊断中的灵敏度较CEA低[11]。CA19-9作为CEA的补充，约7.3%患者CA19-9升高而CEA水平不升高[14]。本研究中CEA和CA19-9在CRC中的灵敏度分别为34.29%和17.14%，均显著低于mSEPT9。在61.53%CRC患者中mSEPT9检测阳性而CEA不升高，在80.77%的患者中mSEPT9检测阳性而CA19-9不升高。以上结果说明mSEPT9与CEA及CA19-9血清学肿瘤标志物相比在CRC辅助诊断中具有更高的灵敏度。本研究结果显示，mSEPT9在CRC中的灵敏度为74.29%，显著高于CEA(34.29%)、CA19-9(17.14%)单独或联合检测(37.14%)。在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中mSEPT9的灵敏度61.54%，高于CEA(15.38%)及CA19-9(7.69%)，差异有统计学意义，说明mSEPT9用于早期CRC的辅助诊断优于CEA和CA19-9，具有更高的敏感性，有望成为CRC早期辅助诊断的指标。

mSEPT9与CEA和(或)CA19-9联合应用均不能提高CRC辅助诊断的灵敏度，差异无统计学意义，说明mSEPT9可以独立作为CRC辅助诊断的分子标记物。但本研究CRC患者样本较少，需要继续扩大样本量进行更大规模的研究来进一步验证mSEPT9与CEA、CA19-9联合检测的价值。

综上所述，mSEPT9与CEA、CA19-9相比在CRC辅助诊断中具有更高的灵敏度，可作为独立的分子标记物用于CRC早期诊断。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.023

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B

1002-266X(2017)41-0068-03

付波(E-mail：fubo.22@163.com)

2017-06-02)