乙型肝炎病毒X蛋白A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响

彭桦，占静，张乙凡，孙飞，邱梦君，杨盛力

(1华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2华中科技大学同济医学院附属协和医院；3贵州医科大学附属医院)

·论著·

乙型肝炎病毒X蛋白A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响

彭桦1，占静2，张乙凡3，孙飞2，邱梦君2，杨盛力2

(1华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2华中科技大学同济医学院附属协和医院；3贵州医科大学附属医院)

目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响。方法将Bel-7404细胞接种于6孔板中,待细胞生长至60%融合时按照Lipofectamine2000的说明书分别将1.0 μg的pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1-mHBx(A1762T/G1764A双突变)质粒转染肝癌细胞系Bel-7404细胞。采用Real-time PCR和Western blotting法检测Bel-7404细胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε mRNA及蛋白表达。结果与转染pcDNA3.1-HBx相比，转染A1762T/G1764A双突变的pcDNA3.1-mHBx表达载体后Bel-7404细胞中Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA和蛋白表达均降低(P均lt;0.05)。结论HBx A1762T/G1764A双突变可引起肝癌细胞生物钟基因表达紊乱。

肝肿瘤；乙型肝炎病毒X蛋白；突变；生物钟；钟控基因

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码的一种多功能蛋白，具有生长因子样作用，可直接刺激细胞生长，并可通过影响正常细胞的细胞周期、干扰DNA修复、调节细胞增殖和凋亡、诱导细胞化疗耐药等，对肝癌的发生发展起重要的推动作用[1～3]。研究发现，HBx在肝癌细胞中常以突变体形式存在，突变后的HBx通常在生物学功能上亦发生变化。A1762T/G1764A双突变是HBx常见的突变方式之一[4]。我们前期研究结果证实，36.5%(36/101)的肝癌组织中存在A1762T/G1764A双突变，且出现双突变的患者预后较差[5]。近年来研究显示生物钟基因表达异常可能是肿瘤发生发展的原因之一[6～8]。肝癌组织中普遍存在生物钟基因表达异常，我们前期研究显示野生型HBx和缺氧微环境同肝癌生物钟基因表达异常密切相关[9,10]。2016年8月，我们探讨了HBx A1762T/G1764A双突变对肝癌细胞生物钟基因表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 兔抗人Clock多克隆抗体、兔抗人Bmal1多克隆抗体、鼠抗人Cry1单克隆抗体和兔抗人Cry2多克隆抗体购于Abcam公司。鼠抗人Per1、Per2和Per3多克隆抗体购于Novus公司。鼠抗人HBx单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司。细胞转染试剂Lipofectamine2000，RNA提取试剂TRIzol和PCR试剂SYBR®Green PCR Master Mix购于Life公司。PCR引物合成由Life公司完成；胎牛血清由Hyclone公司提供。HBx A1762T/G1764A双突变表达载体和肝癌细胞系Bel-7404细胞株由香港中文大学威尔斯亲王医院陈功教授馈赠[11]。

1.2 Bel-7404细胞的质粒转染 将Bel-7404细胞接种于6孔板中,待细胞生长至60%融合时按照Lipofectamine2000的说明书分别将1.0 μg的pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1-mHBx(A1762T/G1764A双突变)质粒转染Bel-7404细胞。48 h后分别提取RNA和总蛋白进行后续检测。

1.3 肝癌细胞生物钟基因mRNA表达检测 采用Real-time PCR技术。根据TRIzol的使用说明提取细胞总RNA，测定RNA纯度和浓度，取mRNA 1 μg逆转录为cDNA。根据SYBR®Green PCR Master Mix(2×)的操作说明书进行定量PCR，每个样本设3个复孔。总反应体系为20 μL：sybrGreen Mix 10 μL，cDNA模板1.5 μL，10 μmol/L的正向和反向引物各1 μL，ddH2O 6.5 μL。Per1引物：正向引物：5′-AGGCAACGGCAAGGACTC-3′，反向引物：5′-GGCTGTAGGCAATGGAACTG-3′，产物大小101 bp；Per2引物：正向引物：5′-CTACAGCAGCACCATCGTC-3′，反向引物：5′-CCACTCGCAGCATCTTCC-3′，产物大小78 bp；Per3引物：正向引物：5′-TGGTGGTGGTGAATGTAAGAC-3′，反向引物：5′-GGCTGTGCTCATCGTTCC-3′，产物大小104 bp；Cry1引物：正向引物：5′-CAACCTCCATTCATCTTTCC-3′，反向引物：5′-CTCATAGCCGACACCTTC-3′，产物大小151 bp；Cry2引物：正向引物：5′-TGGGCTTCTGGGACTGAG-3′，反向引物：5′- GGTAGGTGTGCTGTCTTAGG-3′，产物大小136 bp；Clock引物：正向引物：5′-GCAGCAGCAGCAGCAGAG-3′，反向引物：5′-CAGCAGAGAGAATGAGTTGAGTTG-3′，产物大小149 bp；Bmal1引物：正向引物：5′-TGCCACCAATCCATACACAGAAG-3′，反向引物：5′-TTCCCTCGGTCACATCCTACG-3′，产物大小123 bp；β-actin引物：正向引物：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，反向引物：5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′，产物大小171 bp；HBx引物：正向引物：5′-CGTCCTTTGTTTACGTCCC-3′，反向引物：5′-CAATTTATGCCTACAGCCTCC-3′，产物大小382 bp。

1.4 肝癌细胞生物钟基因蛋白表达检测 采用Western blotting法。蛋白定量后通过10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。分别加入兔抗人Clock多克隆抗体、兔抗人Bmal1多克隆抗体、鼠抗人Cry1单克隆抗体和兔抗人Cry2多克隆抗体、鼠抗人Per1、Per2和Per3多克隆抗体，均1∶500稀释；鼠抗人HBx单克隆抗体1∶250稀释；鼠抗人β-actin单克隆抗体1∶1 000稀释。加入HRP标记的羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗，1∶2 000稀释。化学发光法显色，计算机扫描蛋白质条带后进行灰度分析。将β肌动蛋白(β-actin)作内参照,分别用生物钟基因蛋白/β-actin值代表该生物钟基因蛋白的相对表达量，每个样本重复3次。

2 结果

2.1 Bel-7404细胞中HBx mRNA和蛋白表达 转染野生型HBx及A1762T/G1764A双突变型HBx的Bel-7404细胞中均可检测到HBx mRNA表达,相对表达量分别为0.41±0.04、0.43±0.05，两者比较，Pgt;0.05；Western blotting检测结果显示,转染野生型HBx及A1762T/G1764A双突变型HBx的Bel-7404细胞中均可检测到HBx 蛋白表达，相对表达量分别为0.38±0.08和0.41±0.06，两者比较，Pgt;0.05。

2.2 转染前后肝癌细胞生物钟基因 mRNA表达变化 Real-time PCR结果显示，Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA在转染野生型HBx的Bel-7404细胞中相对表达量分别为1.01±0.01、0.99±0.02、1.01±0.02、1.02±0.02、0.98±0.01、1.00±0.02、0.99±0.01；Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA在转染A1762T/G1764A双突变HBx的Bel-7404细胞中相对表达量分别为0.83±0.02、0.79±0.03、0.98±0.04、0.47±0.03、0.41±0.01、0.86±0.02、0.90±0.02。与转染野生型HBx相比，转染A1762T/G1764A双突变HBx表达载体后Bel-7404细胞中Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA表达降低，差异均有统计学意义(P均lt;0.05)；而Per1基因表达差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

2.3 转染前后肝癌细胞生物钟基因蛋白表达变化 Western blotting检测结果显示，Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白在转染野生型HBx的Bel-7404细胞中相对表达量分别为0.99±0.03、0.97±0.05、1.02±0.04、1.05±0.04、0.98±0.06、1.01±0.03、0.99±0.05；Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白在转染A1762T/G1764A双突变HBx的Bel-7404细胞中相对表达量分别为0.76±0.08、0.63±0.07、0.94±0.12、0.31±0.05、0.33±0.06、0.80±0.09、0.89±0.05。与转染野生型HBx相比，转染A1762T/G1764A双突变的HBx表达载体后Bel-7404细胞中Clock、Bmal1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P均lt;0.05)；Per1蛋白表达差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

3 讨论

生物钟是细胞内潜在的生物节律，在分子水平上由Per1、Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、Cry1、Cry2等多个生物钟基因精密调控。细胞内生物钟基因表达异常可引起其下游的钟控基因表达紊乱。人类基因组中约有40%的mRNA表达具有生物节律性，受生物钟基因调控[12]。这些受生物钟调控的基因包括与细胞增殖和凋亡密切相关的癌基因(c-myc)，抑癌基因(p53，p21)和细胞周期有关的关键调控因子(Cyclin A，Cyclin B1，Cyclin D1，Wee1)，还包括与细胞侵袭转移相关的基因,如血管生成相关基因(血管内皮生长因子)和转移相关基因[13]。这些钟控基因的表达异常可引起细胞增殖、凋亡、侵袭转移等生物学行为发生变化。

HBV感染是肝癌发生发展的常见病因之一。HBV引起肝癌发生发展的确切机制目前尚不清楚，但普遍认为由X基因编码合成的HBx在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。HBx可抑制p53表达和c-myc、Ras等癌基因表达，还可通过甲基化修饰使得细胞周期负调控因子p16INK4A和钙黏蛋白E-cadherin表达减少，进而促进肝细胞的恶性转化[1～3]。我们前期研究发现肝癌组织的基因组中普遍存在HBx基因突变，其中HBV基本核心区启动子(BCP)A1762T/G1764A 双突变发生率为36.5%(36/101)[5]。A1762T/G1764A双突变是肝细胞癌发生的危险因素之一。研究显示A1762T/G1764A双位点突变导致130密码子(AAG)和131密码子(GTC)分别出现ATG和ATC突变，突变位置出现在与p53结合及同反式激活功能密切相关的区域(132～139密码子)相邻部位，使得HBx的反式激活功能明显增强，引起一系列癌基因的激活和抑癌基因的失活，最终导致肝癌的发生发展[4]。我们前期研究显示A1762T/G1764A双突变和肝癌预后密切相关，A1762T/G1764A双突变的患者较易出现复发和转移[5]。

本研究将HBx A1762T/G1764A双突变表达载体转染肝癌细胞，发现生物钟基因除Per1表达无明显变化外，Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、Cry1和Cry2均表达下调。Lin等[14]研究发现，Per1、Per2、Per3、Cry2和Tim在肝癌组织中表达降低。我们前期研究发现Per1、Per2、Per3和Cry2在肝癌组织中的表达低于癌旁组织中[10]。HBx A1762T/G1764A双突变引起的Per2、Per3、Cry2变化趋势同其在肝癌组织中的表达状态一致。因此HBx A1762T/G1764A双突变可能是引起肝癌细胞生物钟基因表达异常的诸多原因之一。

研究显示,Per2和Per3除参与生物钟调控外，还能抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导细胞凋亡，在肿瘤组织中普遍呈低表达状态，被认为是潜在的抑癌基因[8,15]。HBx A1762T/G1764A双突变引起其表达下调，一定程度上可能促进了肝癌的发生发展。细胞的失序性和失控性生长是恶性肿瘤的特征之一。HBx A1762T/G1764A双突变引起肝癌细胞生物钟表达紊乱，进而可能引起下游与细胞增殖、凋亡、侵袭转移相关的钟控基因表达紊乱，从而诱导肝癌发生及促进复发和转移。

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EffectsofhepatitisBvirusXproteinA1762T/G1764Adoublemutationonexpressionofclockgeneinlivercancercells

PENGHua1,ZHANJing,ZHANGYifan,SUNFei,QIUMengjun,YANGShengli

(1LiyuanHospitalofTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan430077,China)

ObjectiveTo investigate the effects of hepatitis B virus X protein A1762T/G1764A double mutation on the expression of clock gene in the hepatocellular carcinoma (HCC) cells.MethodsBel-7404 cells were inoculated into into 6-hole plate, when the cells grew to 60% confluence, they were transfected with 1.0 μg pcDNA3.1-HBx and pcDNA3.1-mHBx (A1762T/G1764A double mutant) plasmids by using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions. The mRNA and protein expression levels of the CLOCK, BMAL1, Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2, and CKIε genes in the Bel-7404 cells were detected by real-time PCR and Western blotting.ResultsThe mRNA and protein expression of Clock, Bmal1, Per2, Per3, Cry1 and Cry2 decreased in Bel-7404 cells transfected with A1762T/G1764A double mutant HBx vectors as compared with that of cells transfected with pcDNA3.1-HBx vectors, and the differences were statistically significant (allPlt;0.05).ConclusionsHBx A1762T/G1764A double mutation can cause the disorder of biological clock expression in HCC cells.

liver neoplasms; hepatitis B virus X protein; mutation; circadian clock; clock controlled gene

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.001

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0001-04

国家自然科学基金资助项目(81702885)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(0118530328)：华中科技大学自主创新基金项目(2016YXM241)；中国肝炎防治基金会-天晴肝病研究基金科研课题(TQGB20170005)；中国博士后科学基金资助项目(2017M613001)。

彭桦(1981-)，男，主治医师，主要研究方向为腹部肿瘤的诊断及治疗。E-mail:2300836708@qq.com

杨盛力(1982-)，男,主治医师，博士后，主要研究方向为肝癌的诊断及治疗。E-mail:yangshengli2014@yahoo.com

2017-07-16)