皂刺粗黄酮对小鼠移植U14宫颈癌细胞生长的影响及机制

张 妍 阮连国 曾友玲 曾 洁

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院，湖北 武汉 430032)

皂刺粗黄酮对小鼠移植U14宫颈癌细胞生长的影响及机制

张 妍 阮连国1曾友玲 曾 洁

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院，湖北 武汉 430032)

目的观察皂刺粗黄酮对小鼠移植U14宫颈癌细胞的影响，并探讨其可能机制。方法制备皂刺粗黄酮浸膏，建立小鼠宫颈癌模型，将小鼠分为观察组1(皂刺粗黄酮低剂量)、观察组2(皂刺粗黄酮中剂量)、观察组3(皂刺粗黄酮高剂量)、环磷酰胺组和对照组(生理盐水组)，称取小鼠始体重、终体重、瘤重，计算抑瘤率和生命延长率，放射免疫法测定血清白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平；免疫组化SP法测定肿瘤组织中p53和增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果观察组1、观察组2、观察组3小鼠的瘤重低于对照组(Plt;0.05)，但高于环磷酰胺组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3小鼠的抑瘤率和生命延长率低于环磷酰胺组(Plt;0.05)。观察组1、观察组2、观察组3小鼠的存活天数高于对照组(Plt;0.05)，但低于环磷酰胺组(Plt;0.05)。观察组1、观察组2、观察组3小鼠血清IL-2和TNF-α高于环磷酰胺组和对照组(Plt;0.05)。观察组1、观察组2、观察组3小鼠的p53和PCNA表达低于对照组(Plt;0.05)，但高于环磷酰胺组(Plt;0.05)；环磷酰胺组小鼠的p53和PCNA表达低于对照组(Plt;0.05)。结论皂刺粗黄酮可升高血清IL-2和TNF-α水平、促进宫颈癌组织中p53和PCNA表达，抑制小鼠移植U14宫颈癌的生长。

皂刺粗黄酮；U14细胞；宫颈癌

寻找毒副作用小、疗效显著的中药对宫颈癌的治疗具有重要意义。皂刺是传统的中药材，具有杀虫、排毒、消肿等功效，具有抗肿瘤作用〔1，2〕。黄酮类化合物毒性比较低，具有抗致癌物质致癌以及抑制肿瘤发生等抗肿瘤作用〔3〕，但不同黄酮类化合物的抗肿瘤作用不完全相同。本文提取皂刺粗黄酮治疗小鼠移植U14宫颈癌，观察其对宫颈癌的影响并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：6～8周龄、雌性、昆明小鼠，体重17～23 g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK(京)2004-0001。瘤株及主要试剂：宫颈癌U14细胞株(中国医学科学院药物研究所)，环磷酰胺(山西泰盛制药有限公司)，鼠抗p53(突变型)单克隆抗体及鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNF-α)放射免疫试剂盒(美国Sigma公司)等。

1.2制备皂刺粗黄酮浸膏 称取皂刺醇2 kg粉碎，加入95%乙醇提取2次，将2次提取液减压浓缩得到皂刺醇浸膏。将皂刺醇浸膏悬浮到水中，滤除不溶物得到水溶物，加入石油醚分层，将石油醚溶解物去除，分步萃取4次得到水相，加入乙酸乙酯，再分步萃取4次得到乙酸乙酯相，减压浓缩得到皂刺粗黄酮浸膏。采用《天然药物化学》中黄酮类化合物显色反应对皂刺粗黄酮进行显色定性鉴定。

1.3建立小鼠宫颈癌模型 将U14宫颈癌细胞株从液氮中取出，水浴融化，离心，弃去上清液，台盼蓝染色计数活细胞率超过95%时，将细胞调整为1×107个/ml，取0.3 ml U14细胞接种到小鼠腹腔内，在小鼠体内传代10 d，无菌条件下取小鼠体内U14细胞，实体瘤模型取0.2 ml(2×106个/ml)接种到小鼠右前肢腋下，腹水瘤模型取0.2 ml细胞注射到腹腔内，接种成功率为100.0%。

1.4分组和处理 将70只昆明小鼠按照随机数字法分为观察组1、观察组2、观察组3、环磷酰胺组和对照组，每组14只。观察组1、观察组2、观察组3分别给予皂刺粗黄酮70、140、280 mg/kg三种剂量灌胃(0.1 ml/10 g)，给药容量0.2 ml/10 g；环磷酰胺组给予环磷酰胺0.1 ml/10 g腹腔注射；对照组给予0.2 ml/10 g生理盐水灌胃；各组小鼠均每天给药1次，共10 d。停药后第2天实体瘤各组按要求取血测量血清IL-2和TNF水平，然后处死各组小鼠。

1.5血清IL-2和TNF-α水平测定 将实体瘤各组小鼠眼球血离心留取血清，采用放射免疫法测定血清IL-2和TNF-α水平。

1.6测定实体瘤抑瘤率及腹水瘤生命延长率 实体瘤各组小鼠处死后取瘤块称重，计算抑瘤率。腹水瘤各组小鼠自然死亡，观察各组小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率，生命延长率=(药物治疗组存活天数-对照组存活天数)/对照组存活天数×100%。

1.7测定肿瘤组织中p53和PCNA表达 将实体瘤小鼠的瘤体进行石蜡包埋，免疫组化SP法测定肿瘤组织中p53和PCNA表达情况，以细胞核呈棕黄色颗粒染色为阳性，取8个高倍视野计算100个肿瘤细胞中染色阳性细胞，求平均值。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件，多组均数之间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1各组小鼠宫颈癌抑制率比较 5组小鼠始体重和终体重比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)，瘤重和抑瘤率比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，其中观察组1、观察组2、观察组3小鼠的瘤重低于对照组(Plt;0.05)，但高于环磷酰胺组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3小鼠的抑瘤率低于环磷酰胺组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3之间瘤重和抑瘤率比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。见表1。

表1 各组小鼠宫颈癌抑制率比较

与环磷酰胺组比较:1)Plt;0.05;与对照组比较:2)Plt;0.05；下表同

2.2各组小鼠存活天数和生命延长率比较 5组小鼠存活天数和生命延长率比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，其中观察组1、观察组2、观察组3小鼠的存活天数高于对照组(Plt;0.05)，但低于环磷酰胺组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3小鼠的生命延长率低于环磷酰胺组(Plt;0.05)。见表2。

2.3各组小鼠血清IL-2和TNF-α比较 5组小鼠血清IL-2和TNF-α比较有统计学差异(Plt;0.05)，其中观察组1、观察组2、观察组3小鼠血清IL-2和TNF-α高于环磷酰胺组和对照组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3小鼠血清IL-2和TNF-α比较无统计学差异(Pgt;0.05)，环磷酰胺组和对照组小鼠血清IL-2和TNF-α比较无统计学差异(Pgt;0.05)。见表2。

2.4各组小鼠p53和PCNA表达比较 5组小鼠p53和PCNA表达比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，其中观察组1、观察组2、观察组3小鼠的p53和PCNA表达低于对照组(Plt;0.05)，但高于环磷酰胺组(Plt;0.05)；环磷酰胺组小鼠的p53和PCNA表达低于对照组(Plt;0.05)；观察组1、观察组2、观察组3小鼠之间p53和PCNA表达比较无统计学差异(Pgt;0.05)。见表2。

表2 各组小鼠存活天数、生命延长率、IL-2、TNF-α及P53和PCNA表达比较

3 讨 论

黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗炎、保肝、降血脂、降胆固醇等作用，在诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性、抗病毒等发面具有显著活性〔4〕。研究发现大豆异黄酮对前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌等多种癌症具有抑制作用，能够诱导癌细胞分化，抑制癌细胞生长和增殖〔5～8〕。红三叶草异黄酮对乳腺癌等有抑制作用〔9〕。皂刺粗黄酮对肺癌等癌症有抑制作用〔10〕。本文表明皂刺粗黄酮对宫颈癌具有抑制作用，但其效果没有环磷酰胺显著。免疫调节是中药抗肿瘤的最普遍的机制。IL-2对杀伤细胞的杀伤能力和T细胞的增殖分化具有重要作用，在正常机体免疫具有正向调节作用，在瘤体内IL-2系统明显被抑制〔11，12〕。TNF-α是机体重要的炎症反应和机体免疫反应调节因子，在促进创伤组织愈合、抗肿瘤、抗感染等方面具有重要作用，其活性可直接杀伤肿瘤细胞〔13〕。本研究表明，皂刺粗黄酮有升高小鼠血清IL-2和TNF-α水平的作用。野生型p53为肿瘤抑制基因，p53基因发生突变时其蛋白构象发生改变，使p53蛋白表达增强，突变型p53的肿瘤抑制活性丧失，在DNA复制水平调节肿瘤细胞生长，是导致肿瘤异常增殖的重要因素〔14，15〕。PCNA存在于细胞核内，和DNA的复制关系密切，调节细胞由DNA合成前期向DNA合成期过度，与肿瘤细胞的增殖关系比较密切〔16，17〕。本研究结果表明，皂刺粗黄酮对小鼠宫颈癌组织中p53和PCNA表达有促进作用。由此可见，皂刺粗黄酮抑制小鼠移植U14宫颈癌的机制可能与皂刺粗黄酮升高血清IL-2和TNF水平、促进宫颈癌组织中p53和PCNA的表达有关。

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〔2017-03-10修回〕

(编辑 徐 杰)

R71

A

1005-9202(2017)22-5553-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.029

武汉市卫计委基金项目(WZ16C23)

1 武汉市医疗救治中心

阮连国(1975-)，男，博士，副主任医师，主要从事急救医学研究。

张 妍(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合妇科疾病研究。