右美托咪定对过氧化氢引起的PC12细胞损伤的保护作用

郑辉哲 王 英 张 援

(福建省肿瘤医院 福建医科大学附属肿瘤医院麻醉科，福建 福州 350014)

右美托咪定对过氧化氢引起的PC12细胞损伤的保护作用

郑辉哲 王 英 张 援

(福建省肿瘤医院 福建医科大学附属肿瘤医院麻醉科，福建 福州 350014)

目的探讨右美托咪定对过氧化氢(H2O2)引起的PC12细胞损伤的保护作用。方法PC12细胞随机分为正常对照组，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，右美托咪定低、中、高浓度组(50、100、200 μmol/L右美托咪定+200 μmol/L H2O2)，培养48 h，分别检测细胞活力、凋亡情况、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Caspase9活性、乳酸脱氢酶(LDH)释放量，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2磷酸化水平。结果与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组细胞活力显著提高，细胞早期及晚期凋亡率显著降低，LDH释放量显著减少，MDA含量显著降低，SOD、CAT及GSH-Px活性显著升高，Caspase3、9活性显著降低，Bcl-2及p-ERK1/2表达量显著上调，Bax表达量显著下调(均Plt;0.01)。结论右美托咪定能通过抗氧化及抗细胞凋亡进而抑制H2O2引起的PC12细胞损伤。

右美托咪定；PC12细胞；过氧化氢(H2O2)；损伤

氧化应激诱导的神经细胞凋亡是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等神经退行性疾病、脑缺血、脑缺血再灌注损伤等病理性脑神经损伤的重要原因〔1〕。过氧化氢(H2O2)，诱导的PC12细胞损伤是目前研究神经细胞氧化应激损伤常见的细胞模型〔2〕。右美托咪定能够促使细胞表面α2肾上腺受体与抑制性G蛋白耦联，进而传递细胞内信号，使机体产生相应反应，在临床上被广泛应用于镇静、镇痛及抗焦虑的治疗〔3〕。目前研究还发现右美托咪定具有显著的神经保护作用，如对利多卡因、谷氨酸及化学性低氧诱导的PC12细胞损伤具有显著的保护作用〔4～6〕，但对H2O2诱导的PC12细胞损伤是否具有保护作用尚未见报道，本研究对此展开探讨。

1 材料与方法

1.1一般材料 细胞、大鼠PC12细胞购于中国科学院上海细胞库。主要试剂与仪器、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体均购自碧云天生物技术研究所；噻唑蓝(MTT)购自美国Gibco公司；Annexin V/PI流式双染试剂盒，水解酶(Caspase)3、9活性检测试剂盒均购自南京凯基生物技术有限公司；兔抗，B淋巴细胞瘤(Bcl)-2，Bcl-2相关X蛋白(Bax),细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2及p-ERK1/2多克隆抗体均购自美国Abcam公司；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒均购自北京索莱宝生物技术有限公司。DYCZ-425D型双垂直电泳仪，DYCZ-40D型转印电泳仪均购自北京六一仪器厂；MK3酶标仪购自美国thermo公司；168-1000XC型酶标仪均购自美国BD公司。

1.2实验分组及给药 取生长对数期PC12细胞随机分为正常对照组，H2O2组，右美托咪定低、中、高浓度组；H2O2组及右美托咪定组预先给予200 μmol/L的H2O2进行诱导24 h，接着右美托咪定组分别给予50、100、200 μmol/L的右美托咪定，正常对照组及模型组均给予等体积培养基进行培养。

1.3噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力 将PC12细胞接种到96孔板，24 h后，按1.2分组及给药后，每个96孔均加入终浓度为20 μl的MTT孵育4 h，翻转96孔板，弃去上清液，接着每孔加入150 μl的二甲基亚砜，使沉淀物溶解并于微量振荡器震荡10 min，最后于酶标仪570 nm处测定OD值。

1.4比色法检测细胞中Caspase3、9活性 将PC12细胞接种到6孔板，24 h后，按1.2分组及给药后，0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并裂解，收获上清液后按照Caspase3、9试剂盒说明书检测其活性，酶标仪405 nm处测定OD值，OD值即代表Caspase3活性。

1.5细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量、MDA含量及SOD、CAT及GSH-Px活性的检测 将PC12细胞接种到6孔板，24 h后，按1.2分组及给药后，0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并裂解，收获上清液后，分别按照试剂盒采用比色法检测LDH释放量及GSH-Px活性，硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，钼氨酸比色法检测CAT活性。

1.6Western印迹检测细胞Bax，Bcl-2及p-ERK1/2蛋白表达 将PC12细胞接种到6孔板，24 h，按1.2分组及给药后，在冰浴条件下刮下细胞，裂解获得细胞上清液即是总蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，蛋白变性。制作浓缩胶和分离胶，蛋白样品上样，进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳，湿法转膜。5%脱脂奶粉室温孵育1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，ERK1/2及p-ERK1/2多隆抗体，小鼠抗GAPDH单克隆抗体，稀释度皆为1∶100)孵育，4℃过夜；二抗室温孵育1 h，凝胶成像系统中曝光。

1.7统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1右美托咪定对H2O2的PC12细胞活力的影响 与正常对照组(0.68±0.07)比较，H2O2组(0.33±0.03)细胞活力显著降低(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组〔(0.46±0.04)，(0.57±0.05)，(0.68±0.06)〕细胞活力显著上升(Plt;0.01)。

2.2右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响 与正常对照组比较，H2O2组早期及晚期细胞凋亡率显著提高(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组早期及晚期细胞凋亡率显著降低(Plt;0.01)。见表1。

2.3右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中LDH释放量、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的影响 与正常对照组比较，H2O2组LDH释放量显著增加，MDA含量升高，SOD、CAT及GSH-Px活性显著降低(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组LDH释放量显著减少，MDA含量显著降低，SOD、CAT及GSH-Px活性显著升高(Plt;0.01)。见表2。

表1 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响

与正常对照组比较：1)Plt;0.01；与H2O2组比较：2)Plt;0.01，下表同

表2 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中LDH释放量、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的影响

2.4右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中Caspase3、9活性的影响 与正常对照组比较，H2O2组Caspase3、9活性显著提高(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组Caspase3、9活性显著降低(Plt;0.01)。见表3。

2.5右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中Bax及Bcl-2表达的影响 与正常对照组比较，H2O2组Bcl-2表达量显著下调，Bax表达量显著上调(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组中Bcl-2表达量显著上调，右美托咪定中、高浓度组中Bax表达量显著下调(Plt;0.01)。见表4，图1。

表3 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中Caspase3、Caspase9活性的影响

2.6右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中ERK1/2磷酸化水平的影响 与正常对照组比较，H2O2组中p-ERK1/2表达量显著上调(Plt;0.01)；与H2O2组比较，右美托咪定低、中、高浓度组中p-ERK1/2表达量显著下调(Plt;0.01)。见表4，图2。

表4 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中Bax、Bcl-2及p-ERK1/2/ERK1/2表达的影响

A：正常对照组；B：模型组；C～E：右美托咪定低浓度组、中浓度组、高浓度组；下图同图1 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中Bax及Bcl-2表达的影响

图2 右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞中ERK1/2磷酸化水平的影响

3 讨 论

氧化应激是机体由于抗氧化能力减弱，氧化作用增强，产生大量活性氧使得机体处于不同程度的氧化应激损伤，如细胞膜过脂质化，细胞毒性作用，蛋白的异常表达等〔1〕。PC12细胞是一种来源于大鼠肾上腺嗜络细胞瘤的细胞，与神经元的形态、结构及功能异常相似，因此被常用来作为研究神经生长、分化、凋亡、损伤等的模型细胞〔2〕。本研究参照相关文献〔2〕，结果说明H2O2诱导的PC12细胞氧化应激模型成功。右美托咪定是一种α2肾上腺受体激动剂，α2受体广泛分布于中枢神经系统中，因此右美托咪定能够通过激动突触前膜及后膜的α2受体，进而抑制去甲肾上腺素的释放及交感神经活性，从而使机体产生镇静、镇痛等作用〔3〕。目前研究发现右美托咪定还能显著抑制利多卡因、谷氨酸及化学性低氧诱导的PC12细胞损伤〔4～6〕。本研究结果表明右美托咪定能显著提高H2O2诱导的PC12细胞活力，并降低细胞凋亡率，与右美托咪定提高利多卡因、谷氨酸及化学性低氧诱导的PC12细胞活力结果一致〔4～6〕，提示右美托咪定对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有显著的抑制作用。LDH是糖酵解途径的关键酶之一，其含量升高是细胞受损的重要标记〔7〕。MDA是细胞膜脂质过氧化的产物，其活性升高说明细胞膜受到氧化应激损伤〔8〕。SOD、CAT及GSH-Px是细胞内抗氧化作用酶，其活性降低说明细胞抗氧化作用降低〔9〕。本研究表明右美托咪定可以通过抗氧化应激抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤。

细胞的凋亡受细胞凋亡基因的调控，其中Bcl-2家族蛋白最为常见。Bcl-2是研究较为广泛的抑制凋亡蛋白，能够与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号传递，促进细胞存活与生长。而Bax还能够自身形成二聚体，将凋亡信号传递给Caspase家族，使Caspase家族产生级联放大反应，诱导细胞凋亡。Caspase家族接收到上游凋亡信号后，起始Caspase9将信号逐级传递并最终传递给Caspase3，导致DNA断裂，细胞膜破裂，最终引起细胞凋亡。而细胞的生长、增殖、分化、凋亡等过程受多种信号通路的调控，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路就是其中一种〔10〕。MAPK包括5个亚族，其中ERK是与细胞增殖、凋亡最为密切相关的亚族。ERK1/2在正常生理条件下处于细胞质中，当受到上游蛋白激活后，ERK1/2转入细胞核中，调控相关蛋白表达，参与细胞的增殖、凋亡等生物学行为。同时有研究证实H2O2诱导的PC12细胞中Caspase3、9活性提高，Bax表达量上调，Bcl-2表达量下调，ERK1/2磷酸化水平提高〔8，9，11〕，因此当阻断此过程能一定程度上的抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡。本研究结果表明，右美托咪定能显著的降低Caspase3、9活性，上调Bcl-2及p-ERK1/2表达，下调Bax表达，最终抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡。

总之，右美托咪定能显著的抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤，与右美托咪定抗氧化应激及抗细胞凋亡有关。

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4Wang Q，She Y，Bi X，etal.Dexmedetomidine protects PC12 cells from lidocaine-induced cytotoxicity through downregulation of COL3A1 mediated by miR-let-7b〔J〕.DNA Cell Biol，2017；36(7)：518-28.

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7Chen L，Sun L，Liu Z，etal.Protection afforded by quercetin against H2O2-induced apoptosis on PC12 cells via activating PI3K/Akt signal pathway〔J〕.J Recept Signal Transduct Res，2016；36(1)：98-102.

8Lin X，Wu S，Wang Q，etal.Saikosaponin-D reduces H2O2-induced PC12 cell apoptosis by removing ROS and blocking MAPK-dependent oxidative damage〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2016；36(8)：1365-75.

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11Ma S，Liu X，Xun Q，etal.Neuroprotective effect of Ginkgolide K against H2O2-induced PC12 cell cytotoxicity by ameliorating mitochondrial dysfunction and oxidative stress〔J〕.Biol Pharm Bull，2014；37(2)：217-25.

〔2017-04-21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

ProtectiveeffectofdexmedetomidineonPC12cellinjuryinducedbyH2O2

ZHENGHui-Zhe,WANGYing,ZHANGYuan.

DepartmentofAnesthesiology,FujianCancerHospitalamp;FujianMedicalUniversityAffiliatedCancerHospital,Fuzhou350014,Fujian,China

ObjectiveTo explore protective effect of dexmedetomidine on PC12 cell injury induced by H2O2.MethodsPC12 cell was randomized into normal control, H2O2(200 μmol/L H2O2), dexmedetomidine low, medium and high-dose groups (50, 100, 200 μmol/L dexmedetomidine +200 μmol/L H2O2) and was cultured for 48 h. Cell viability, cell apoptosis, the activity of cysteinyl aspartate specific proteinase (Caspase) 3, Caspase9, lactate dehydrogenase (LDH) release, malondialdehyde (MDA) content, the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px), the expression of B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl-2 associated X protein (Bax), phosphorylation of extracellular regulated protein kinases 1/2 (ERK1/2) were measured.ResultsCompared with H2O2group, cell viability was increased (Plt;0.01), the cell apoptosis rate, the activity of Caspase3, Caspase9, LDH release and MDA content were reduced (Plt;0.01), the activity of SOD, CAT and GSH-Px were increased (Plt;0.01), the expression of Bcl-2 and p-ERK1/2 were up-regulated (Plt;0.01), the expression of Bax was down-regulated (Plt;0.01) in dexmedetomidine low, medium and high-dose groups.ConclusionsDexmedetomidine suppresses PC12 cell injury induced by H2O2via anti-oxidation and anti-apoptosis.

Dexmedetomidine; PC12 cell; H2O2; Injury

R614

A

1005-9202(2017)22-5500-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.007

国家自然科学基金青年科学基金项目(No.81400921)；人社部2016年度留学人员科技活动项目择优资助项目(2016年)

郑辉哲(1971-)，男，硕士，副主任医师，主要从事麻醉和疼痛治疗研究。