异泽兰黄素抑制瘢痕组织成纤维细胞增殖的机制

李 响 刘宏伟 梁 杰 吴志远 张培华 吴志贤

(暨南大学附属第一医院整形科，广东 广州 510630)

异泽兰黄素抑制瘢痕组织成纤维细胞增殖的机制

李 响1刘宏伟 梁 杰1吴志远1张培华1吴志贤1

(暨南大学附属第一医院整形科，广东 广州 510630)

目的探讨异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞增殖的影响及机制。方法应用MTT 法检测异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞活力的影响，流式细胞仪检测异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞中活性氧(ROS)的生成及细胞凋亡的影响，Western印迹法检测异泽兰黄素对细胞内JNK和Bcl2磷酸化的影响。结果2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml异泽兰黄素作用细胞24 h后，细胞活力呈浓度依赖性降低。ROS抑制剂(NAC)预处理细胞1 h能显著抑制异泽兰黄素对细胞活力的抑制作用。10.0 μg/ml异泽兰黄素作用细胞24 h能促进细胞ROS生成和细胞凋亡，细胞凋亡率为(47.20±1.60)%，与正常对照组相比具有显著统计学差异；促进JNK磷酸化水平和Bcl2表达水平，JNK磷酸化水平为(3.12±0.25)倍，Bcl2磷酸化水平为(2.84±0.22)倍，与正常对照组相比具有显著性差异。JNK磷酸化抑制剂和NAC均能显著抑制异泽兰黄素诱导的细胞凋亡和JNK的磷酸化。结论异泽兰黄素可诱导瘢痕组织成纤维细胞ROS的产生，通过激活JNK/Bcl2通路诱导细胞凋亡，从而抑制成千维细胞的增殖活性。

异泽兰黄素；瘢痕成纤维细胞；活性氧；细胞凋亡；JNK通路

作为一种病理性瘢痕，瘢痕疙瘩因其浸润性生长的特性，治疗后极易复发。因此，对于该病如何预防和有效治疗，一直是亟待整形外科界解决的问题〔1〕。成纤维细胞是瘢痕疙瘩形成与增生的效应细胞，瘢痕疙瘩组织学表现为成纤维细胞大量增生〔2〕。中医药对病理性瘢痕的防治有着悠久的历史，具有较好疗效。异泽兰黄素(Eupatilin)分子式为C18H16O7，属于O-甲基黄酮，是中药艾叶里面发现的一种重要的黄酮类活性成分〔3〕，有研究表明，异泽兰黄素对胃癌有明显的治疗作用，能够通过下调核因子(NF)-κB活性抑制人胃癌细胞的侵袭和增殖能力〔4〕。本研究探讨异泽兰黄素促凋亡作用与活性氧(ROS)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的关系，进一步阐明其抑制瘢痕成纤维细胞生长的作用及分子机制，为异泽兰黄素治疗瘢痕疙瘩提供依据。

1 材料和方法

1.1细胞株 瘢痕疙瘩临床标本7例，男4例，女3例，年龄(40.7±3.5)岁。来源于广东医科大学附属医院整形外科门诊及住院手术患者。在行手术切除前，所有患者均未经过其他治疗且无其他的全身器质性病变。所有标本均根据临床和病理(HE染色切片的组织学检查) 诊断证实。标本都经广东医科大学附属医院医学伦理委员会的论证、许可，且均取得患者的知情与同意。采用手术切除的方法获得正常皮肤或者瘢痕疙瘩组织，运用组织块培养法对其原代培养，整个过程中均需无菌操作。当成纤维细胞长出且融合成片时开始传代，选取传至3～8代的成纤维细胞进行实验。

1.2药品、试剂和仪器 异泽兰黄素购于美国Sigma，薄层色谱法(TLC)检测药物的纯度≥98%，CAS：22368-21-4；用PBS溶解制得10 mg/ml的异泽兰黄素溶液，培养液稀释得到2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml浓度的溶液。曲安奈德 (Triamcinolone acetonide) 购于美国Sigma，TLC检测药物纯度≥99%，CAS：76-25-5；采用DMSO配制得50 mg/ml的曲安奈德溶液待用。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；JNK、p-JNK、Bcl2抗体(美国CST公司)；HRP标记羊抗兔IgG、DCFH-DA ROS检测试剂盒、ROS抑制剂N-acetyl-l-cysteine(NAC，中国碧云天生物技术)；p-JNK抑制剂SP600125(美国Selleck公司)。流式细胞仪(FACSCanto Ⅱ，美国BD)；多功能酶标仪、多功能凝胶成像系统(VersaDoc MP5000，美国Bio-Rad)。

1.3方法

1.3.1细胞的培养 将原代分离的人瘢痕成纤维细胞单层接种在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁生长，常规换液；在细胞密度汇合至90%～95%时，0.25%胰酶消化传代培养。

1.3.2MTT法检测异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞活力的影响 取对数生长期的瘢痕成纤维细胞，0.25%胰酶消化离心，将细胞浓度调整为2.5×104个/ml，均以100 μl/孔种植于96孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后加入不同终浓度(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml)的异泽兰黄素；或加入终浓度为5.0 mmol/L的NAC培养1 h后再加入不同终浓度的异泽兰黄素。每组设置6 个复孔，同时设置阴性对照(PBS处理)，置于培养箱中继续培养24 h，每孔加入5.0 mg/ml MTT 10 μl再培养3 h，弃上清液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，于酶标仪490 nm下测定各孔吸光值(A490)。

1.3.3异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞内ROS的影响 取对数生长期的瘢痕成纤维细胞，0.25%胰酶消化离心，调整细胞浓度为2.5×104个/孔种植于6孔板，培养24 h后加入终浓度为40.0 μg/ml的异泽兰黄素(MTT实验结果表明40.0 μg/ml的异泽兰黄素能显著抑制细胞活力，因此选用其为以下研究的浓度)，或分别加入终浓度为5.0 mmol/L的NAC和10.0 μmol/L p-JNK抑制SP600125培养1 h后再加入终浓度为40.0 μg/ml异泽兰黄素培养24 h。取处理后的细胞，0.25%胰酶消化离心收集细胞，PBS漂洗2次后，加入终浓度为5.0 μmol/L的DCFH-DA染色液，37℃作用30 min，PBS漂洗2次，用流式细胞仪测定细胞内二氯荧光素的平均荧光强度，从而分析异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞内ROS水平的影响。

1.3.4流式细胞仪检测异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞凋亡的影响 通过Annexin V-FITC/PI双染法检测异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。细胞接种及给药处理同“1.3.2”，按照试剂盒的操作说明书，通过1×Annexin Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl稀释的Annexin V-FITC在冰上孵育30 min，再用5 μl稀释的PI对细胞进行复染，冰上孵育5 min后立即用流式细胞仪进行检测。

1.3.5Western印迹检测JNK信号通路蛋白表达 细胞接种及给药处理同“1.3.2”，PBS洗涤后加入100 μl的细胞裂解液RIPA裂解细胞，10 000 r/min离心15 min，取上清即为蛋白样品。采用BCA蛋白测定试剂盒对上清液的总蛋白进行蛋白定量，从每个样品中取总蛋白30 μg加入电泳上样缓冲液，100℃煮沸5 min，12% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，在电泳后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶300稀释的Ⅰ抗，4℃孵育过夜。第2天用TBST洗膜5 min×3次，加入1∶5 000稀释的HRP标记的Ⅱ抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜6次，每次5 min，加入ECL化学发光液进行显色，用Bio-rad凝胶成像系统进行拍照，运用ImageJ2x软件进行灰度值分析。

1.4统计学处理 实验至少重复3次,采用SPSS20.0 软件，多组间比较采用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，进一步两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞增殖的影响 异泽兰黄素可剂量依赖性地抑制瘢痕成纤维细胞增殖。MTT结果显示，异泽兰黄素处理组与对照组相比有显著性差异(Plt;0.01)。2.5～40.0 μg/ml异泽兰黄素处理24 h对瘢痕成纤维细胞增殖具有不同程度的抑制作用，其IC50为10.65 μg/ml，用10 μg/ml的浓度进行后续细胞实验。加入5.0 mmol/L NAC后，浓度低于20.0 μg/ml的异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞增殖的抑制率明显降低。见表1。

表1 异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞增殖率的影响

与对照组比较：1)Plt;0.01；与预处理组比较：2)Plt;0.05

2.2异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞ROS产生的影响 ROS表达量表异泽兰黄素处理组(3 750±26)与对照组(1 781±4)间有显著差异(Plt;0.01)。10.0 μg/ml异泽兰黄素作用于瘢痕成纤维细胞24 h能显著诱导细胞内ROS的生成，NAC能显著抑制异泽兰黄素诱导ROS的生成(1 840±18)，SP600125对异泽兰黄素诱导的ROS(3 708±22)没有明显的影响，表明异泽兰黄素并不是通过JNK磷酸化诱导ROS的产生。曲安奈德组ROS水平为1 750±8。

2.3异泽兰黄素对瘢痕组织成纤维细胞凋亡的影响 异泽兰黄素处理组凋亡率〔(47.2±1.6)%〕与对照组〔(7.9±0.8)%〕相比具有显著差异(Plt;0.01)。10.0 μg/ml异泽兰黄素处理24 h诱导的细胞凋亡率显著增加，加入活性氧抑制剂NAC〔(9.6±0.9)%〕和p-JNK抑制剂SP600125〔(12.8±1.1)%〕均能显著抑制异泽兰黄素诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡(Plt;0.01)，表明异泽兰黄素诱导瘢痕成纤维细胞凋亡与ROS和JNK的磷酸化相关。曲安奈德组凋亡率为〔(36.1±1.2)%〕。

2.4异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞JNK/Bcl2磷酸化的影响 免疫印迹检测结果表明，10.0 μg/ml异泽兰黄素能显著增强p-JNK和Bcl2的磷酸化水平，ROS抑制剂NAC能显著抑制异泽兰黄素诱导p-JNK和Bcl2的磷酸化增加，表明异泽兰黄素诱导瘢痕成纤维细胞ROS的生成、促进JNK的磷酸化，从而激活JNK/Bcl2通路，促进Bcl2表达，诱导细胞凋亡。见图1，表2。

图1 异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞JNK、p-JNK及Bcl2蛋白表达的影响

组别Bcl2JNKp-JNK/JNK对照组1.001.001.00异泽兰黄素组3.12±0.251.06±0.312.84±0.221)NAC组0.89±0.151.03±0.170.87±0.052)SP600125组0.95±0.111.06±0.150.92±0.062)曲安奈德组1.15±0.581.08±0.151.06±0.42

与对照组比较：1)Plt;0.01；与异泽兰黄素组比较：2)Plt;0.01

3 讨 论

瘢痕疙瘩是皮肤创伤后引发的以成纤维细胞异常增殖并分泌大量细胞外基质为主要特征的皮肤纤维化疾病，治疗效果不佳，复发率较高，发病机制尚不清楚〔5〕。瘢痕疙瘩虽是一种良性皮肤肿瘤，但无自愈倾向，瘢痕疙瘩往往不断侵蚀周围正常皮肤，经久不愈、反复感染者有癌变倾向〔6〕。因此，阐明瘢痕疙瘩的分子发病机制，针对其发病的特异性环节研究和开发治疗瘢痕疙瘩的新药已成为迫切需要。在瘢痕疙瘩中，成纤维细胞的密度普遍增高，其异常的增殖、分化、凋亡都直接造成了瘢痕疙瘩的生成〔7〕。故而，在瘢痕疙瘩的发生机制研究中，针对瘢痕成纤维细胞作用的研究最广泛亦最清晰。

本研究通过MTT检测结果表明，异泽兰黄素能诱导瘢痕成纤维细胞ROS生成和细胞凋亡，提示异泽兰黄素可能通过诱导瘢痕成纤维细胞ROS生成而产生促凋亡作用。

ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的分子，一直以来被认为是肿瘤发生发展的重要因素〔8〕。随着自由基生物学研究的发展，研究者们逐渐认识到ROS 可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，并发现了自由基与细胞信号转导之间的内在关联。肿瘤细胞自身能够诱导氧化应激，其内部的 ROS 水平高于正常细胞，对于ROS的敏感度也高于正常细胞，同时肿瘤细胞中SOD、GPx等抗氧化酶的含量低于正常细胞。鉴于肿瘤细胞内高浓度的ROS以及抗氧化损伤防御系统的缺陷等因素，在同等浓度ROS的作用下，肿瘤细胞较正常细胞而言肿瘤细胞更先发生凋亡〔9〕。大量研究表明，ROS可通过促进肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤细胞坏死和参与自噬性细胞死亡等方面发挥抑瘤作用〔10〕。本研究表明异泽兰黄素能够诱导瘢痕成纤维细胞ROS的生成，通过ROS清除剂NAC清除了异泽兰黄素诱导的ROS之后，异泽兰黄素诱导的细胞凋亡被抑制，表明ROS在异泽兰黄素诱导的细胞凋亡中发挥着重要的作用。

JNK是促分裂原活化蛋白激酶MAPK家族重要成员之一，可以调控细胞内外不同的应激反应〔11〕。近年来，国内外学者研究发现JNK信号通路能介导多种细胞外刺激诱导的细胞凋亡，在调控细胞凋亡中发挥重要作用，JNK信号通路介导的细胞凋亡参与了人类多种疾病发生发展的过程〔12～14〕。JNK磷酸化不仅能够活化p53依赖的细胞凋亡，而且能够调整Bcl2家族蛋白，使Bcl2促凋亡蛋白活化，抑制抗凋亡蛋白活性，从而介导细胞凋亡的发生〔15〕。大量研究表明，ROS作为第二信使参与JNK信号通路的活化。ROS可通过调节ASK1、Src和MLK3等途径激活JNK通路〔11,16～18〕。ROS/JNK信号通路是哺乳动物细胞中诱发细胞凋亡的一条重要途径。本研究中异泽兰黄素处理瘢痕成纤维细胞后，磷酸化JNK和Bcl2的表达水平明显增加，表明异泽兰黄素能够激活JNK/Bcl2通路，而加入JNK磷酸化抑制剂SP600125后，异泽兰黄素诱导的细胞凋亡被抑制，证明异泽兰黄素通过激活JNK/Bcl2通路而诱导瘢痕成纤维细胞凋亡。加入NAC后，异泽兰黄素诱导的JNK磷酸化水平明显降低，表明在此过程中，异泽兰黄素通过ROS/JNK/Bcl2通路诱导细胞凋亡。

总之，本研究表明异泽兰黄素通过诱导ROS的产生，促进了JNK磷酸化从而激活JNK/Bcl2信号通路，继而诱导瘢痕成纤维细胞凋亡，抑制了瘢痕成纤维细胞的生长。阐明了异泽兰黄素抑制人瘢痕组织成纤维细胞生长的作用机制，将有可能为异泽兰黄素应用于临床瘢痕疙瘩的治疗提供理论基础。

1Zhu HY,Bai WD,Li J,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist troglitazone suppresses transforming growth factor-beta1 signalling through miR-92b upregulation-inhibited Axl expression in human keloid fibroblasts in vitro〔J〕.Am J Transl Res,2016;8(8):3460-70.

2Jiao H,Dong P,Yan L,etal.TGF-beta1 induces polypyrimidine tract-binding protein to alter fibroblasts proliferation and fibronectin deposition in keloid〔J〕.Sci Rep,2016;6:38033.

3Cho JH,Lee JG,Yang YI,etal.Eupatilin,a dietary flavonoid,induces G2/M cell cycle arrest in human endometrial cancer cells〔J〕.Food Chem Toxicol,2011;49(8):1737-44.

4Park BB,Yoon J,Kim E,etal.Inhibitory effects of eupatilin on tumor invasion of human gastric cancer MKN-1 cells〔J〕.Tumour Biol,2013;34(2):875-85.

5Ma HL,Zhao XF,Chen GZ,etal.Silencing NLRC5 inhibits extracellular matrix expression in keloid fibroblasts via inhibition of transforming growth factor-beta1/Smad signaling pathway〔J〕.Biomed Pharmacother,2016;83:1016-21.

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7Wu X,Bian D,Dou Y,etal.Asiaticoside hinders the invasive growth of keloid fibroblasts through inhibition of the GDF-9/MAPK/Smad pathway〔J〕.J Biochem Mol Toxicol,2017;31(8):doi:10.1002;bt.21922.

8Zou P,Zhang J,Xia Y,etal.ROS generation mediates the anti-cancer effects of WZ35 via activating JNK and ER stress apoptotic pathways in gastric cancer〔J〕.Oncotarget,2015;6(8):5860-76.

9Sun L,Fan H,Yang L,etal.Tyrosol prevents ischemia/reperfusion-induced cardiac injury in H9c2 cells:involvement of ROS,Hsp70,JNK and ERK,and apoptosis〔J〕.Molecules,2015;20(3):3758-75.

10Wang Y,Sun Z,Chen S,etal.ROS-mediated activation of JNK/p38 contributes partially to the pro-apoptotic effect of ajoene on cells of lung adenocarcinoma〔J〕.Tumour Biol,2016;37(3):3727-38.

11Deng L,Chen M,Tanaka M,etal.HCV upregulates Bim through the ROS/JNK signalling pathway,leading to Bax-mediated apoptosis〔J〕.J Gen Virol,2015;96(9):2670-83.

12Zhang Y,Liao H,Zhong S,etal.Effect of N-n-butyl haloperidol iodide on ROS/JNK/Egr-1 signaling in H9c2 cells after hypoxia/reoxygenation〔J〕.Sci Rep,2015;6651(5):11809.

13Zhang X,Wang X,Wu T,etal.Isoliensinine induces apoptosis in triple-negative human breast cancer cells through ROS generation and p38 MAPK/JNK activation〔J〕.Sci Rep,2015;5(5):12579.

14Suzuki M,Bandoski C,Bartlett JD.Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling〔J〕.Free Radic Biol Med,2015;89(3):369-78.

15Stander XX,Stander BA,Joubert AM.Synergistic anticancer potential of dichloroacetate and estradiol analogue exerting their effect via ROS-JNK-Bcl-2-mediated signalling pathways〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;35(4):1499-526.

16Liu GY,Jiang XX,Zhu X,etal.ROS activates JNK-mediated autophagy to counteract apoptosis in mouse mesenchymal stem cells in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2015;36(12):1473-9.

17Harmalkar M,Upraity S,Kazi S,etal.Tamoxifen-induced cell death of malignant glioma cells is brought about by oxidative-stress-mediated alterations in the expression of Bcl2 family members and is enhanced on miR-21 inhibition〔J〕.J Mol Neurosci,2015;57(2):197-202.

18Choudhury S,Ghosh S,Gupta P,etal.Inflammation-induced ROS generation causes pancreatic cell death through modulation of Nrf2/NF-kappaB and SAPK/JNK pathway〔J〕.Free Radic Res,2015;49(11):1371-83.

〔2017-02-15修回〕

(编辑 徐 杰)

R364

A

1005-9202(2017)22-5495-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.005

国家自然科学基金资助项目(81372065)

1 广东医科大学附属医院整形外科

刘宏伟(1965-)，男，主任医师，教授，博士，主要从事自体脂肪移植，面部年轻化研究。

李 响(1981-)，女，主治医师，硕士，主要从事瘢痕、脂肪移植等研究。