远志皂苷对APP/PS1 双转基因小鼠海马神经细胞线粒体的保护作用

帅智峰 韩丽君 弓 箭 王俊苹 李公启 吴淑琴 董海影

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

远志皂苷对APP/PS1 双转基因小鼠海马神经细胞线粒体的保护作用

帅智峰 韩丽君 弓 箭 王俊苹 李公启 吴淑琴 董海影

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的观察远志皂苷对APP/PS1 双转基因小鼠海马神经细胞线粒体功能的调控，探讨远志皂苷的神经保护作用机制。方法将APP/PS1 双转基因小鼠分为模型组，远志皂苷低、中和高剂量组(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，选同月龄C57BL/6小鼠为空白对照组，采用免疫荧光检测海马神经细胞线粒体膜电位，流式细胞术检测细胞凋亡率，比色法等检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量。结果与空白对照组相比，模型组线粒体膜电位降低，神经细胞凋亡率增高，SOD，过氧化氢酶(CAT)和(GSH-PX)活性明显降低，MDA 含量明显增高；与模型组相比，远志皂苷各剂量组的线粒体膜电位升高，神经细胞凋亡率下降，SOD，CAT 和GSH-PX活性明显升高，MDA 含量明显降低(Plt;0.05)。结论远志皂苷可能通过调控线粒体功能，发挥保护海马神经元的作用。

远志皂苷；APP/PS1；线粒体

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知功能减退为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止发病机制尚不十分清楚，药物的疗效也不十分明确〔1〕。远志为远志科多年生草本植物，最早记载于《神农本草经》，其性温，味苦、辛，具有抗氧化、抗衰老、抗痴呆和脑保护作用等多种生理活性〔2〕。远志的主要药理活性成分为远志皂苷(TEN)，现代药理学研究发现，TEN具有防治AD的作用〔3，4〕。本文主要探讨TEN对APP/PS1 双转基因小鼠海马神经细胞线粒体功能的调控，探讨TEN的神经保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)均由南京建成生物工程研究提供(批号：20150422、20150423、20150423和20150417)。

1.2动物 APP/PS1 双转基因小鼠(南京生物医药研究院，编号D000268)，4月龄，50只均为雄性；C57BL/6J小鼠10只。所有小鼠均饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心SPF级饲养室。

1.3方法

1.3.1分组和给药 将APP/PS1双转基因小鼠分为模型组，TEN低、中和高剂量组(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，选同月龄C57BL/6小鼠为空白对照组，空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃2 w。

1.3.2海马线粒体制备 末次行为学测试结束后，在冰台上分离海马组织，置于匀浆器中，加入适量的0～4℃线粒体分离介质，制备匀浆，离心取上清，再离心取沉淀，加入分离介质，离心取沉淀，加入分离介质，获取线粒体悬液。

1.3.3流式细胞术检测细胞凋亡率 将获取的线粒体悬液加入荧光染色液，然后进行避光孵育，用流式细胞仪分析。

1.3.4SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的检测 将获取的线粒体悬液用酶标法检测SOD，硫代巴比妥酸法检测MDA，分光光度法检测CAT，比色法检测GSH-PX。

1.3.5免疫荧光检测海马神经细胞线粒体膜电位 取新鲜海马组织样本并压平，清洗后浸入染色液，置于37℃培养箱孵育，抽去染色液，清洗后切片，镜下观察拍照。

1.4统计方法 采用SPSS16.0软件，组间比较用单因素方差分析。

2 结 果

2.1TEN对各组脑组织海马神经细胞凋亡率的影响 与空白对照组〔(4.97±0.27)%〕比较，模型组细胞凋亡率〔(35.22±8.05)%〕明显增高(Plt;0.05)；与模型组相比，TEN高、中、低剂量组〔(7.59±0.96)%,(8.04±1.09)%,(17.73±3.34)%〕均能明显降低细胞凋亡率 (Plt;0.05)，且TEN高、中剂量组间相比差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

2.2免疫荧光检测各组线粒体细胞膜电位的变化 与空白对照组比较，模型组细胞膜电位下降(红色荧光明显减少，绿色荧光增加)，与模型组相比，TEN低剂量组红色荧光增加，中剂量组和高剂量组的红色荧光明显增强，说明线粒体膜电位开始回升。见图1。

2.3TEN对脑组织SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的影响 与空白对照组比较，模型组脑组织SOD、CAT、GSH-PX活性明显降低，MDA 含量明显增高(Plt;0.05)；与模型组比较，TEN高、中剂量组均能明显升高SOD、CAT、GSH-PX活性(Plt;0.05)，TEN高、中剂量组均能明显降低MDA 含量(Plt;0.05)，且呈现剂量依赖效应；上述参数TEN高、中剂量组间比较无明显差异(Pgt;0.05)。见表1。

图1 线粒体细胞膜电位变化(×200)

组别GSH-PX(U/mg)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)CAT(U/mg)空白对照组609.69±45.597.75±1.3633.59±3.0830.89±2.81模型组314.61±54.311)15.17±4.771)17.30±2.151)13.12±1.081)TEN低剂量组403.77±27.831)12.37±2.1621.28±3.102)19.76±3.372)TEN中剂量组515.04±33.342)8.59±2.072)27.48±2.782)24.72±3.072)TEN高剂量组567.28±48.922)8.08±1.752)26.55±3.562)23.31±2.752)

与空白对照组比较：1)Plt;0.05；与模型组比较：2)Plt;0.05

3 讨 论

AD病因学研究发现，神经细胞线粒体结构缺陷和功能改变是导致AD 病人脑内神经细胞凋亡的重要因素，线粒体对细胞凋亡发挥着中心调控作用〔5〕。线粒体是由外膜、内膜、膜间隙和基质构成的封闭囊状结构。线粒体氧化磷酸化产生的能量是维持脑内神经元正常功能的必须要素。线粒体的基本功能就是通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供必需能量，其产生能量的过程主要依赖跨膜电位，线粒体基质内的质子由质子泵进入内外膜间隙，形成横跨线粒体内膜的线粒体跨膜电位，从而在ATP 合酶的作用下生成ATP〔6〕。线粒体膜电位是生物膜两侧离子浓度不同产生的跨膜电位差，可以作为评价线粒体功能的敏感指标〔6〕。当膜电位下降时，就会引起线粒体氧化磷酸化效率下降，进而生成大量的氧自由基，导致细胞损伤与凋亡〔7〕。对抗活性氧簇(ROS)的抗氧化防御体系包括酶系统，如SOD、GSH和CAT，这些酶代表着机体的第一道抗氧化防御体系。其中SOD是体内天然存在的氧自由基清除剂，其活性的高低可以作为机体清除氧自由基能力的指标，而GSH是机体内重要的抗氧化剂，能够清除自由基，发挥抗氧化作用；MDA是体内的脂质代谢产物，是脂质过氧化的主要降解产物，其含量的高低可以作为机体细胞受自由基攻击程度的指标〔8〕。

现代药理学研究发现，益智中药远志的有效成分具有抗痴呆、御氧化和防衰老等药理活性〔9〕。本文研究结果显示，TEN能显著抑制APP/PS1 双转基因小鼠神经细胞凋亡，在改善线粒体膜电位的同时还能显著抑制SOD、CAT和GSH活性并MDA含量，呈现剂量依赖效应，治疗效果最佳浓度为74.0 mg·kg-1·d-1。可见，TEN对线粒体的功能具有较好的保护作用，可能与其通过维持线粒体膜电位的稳定性，保持线粒体氧化磷酸化的偶联程度，提高抗氧化酶活性与减少自由基的产生，抑制细胞凋亡的作用机制有关。

1官 杰，李 浩，刘建刚，等.还脑益聪方组分对APP转基因小鼠脑组织炎症因子和氧化应激的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2011；27(4)：732-8.

2滕红梅，胡正海.远志的生物学及化学成分研究进展〔J〕.中草药,2007；38(8)：1276-9.

3陈 勤，陈逸青，叶海燕，等.远志皂苷通过UPP 通路清除AD 大鼠脑神经细胞代谢废物积聚的作用机制研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2015；35(3)：327-32.

4黄 炎，陈逸青，陈 勤，等.远志皂苷对Aβ1-40 诱导痴呆大鼠海马神经细胞线粒体的保护作用〔J〕.中药药理与临床，2015；31(1)：93-7.

5Han XJ，Tomizawa K，Fujimura A，etal. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases〔J〕.Acta Med Okayama，2011；65(1)：1-10.

6Ly JD，Grubb DR，Lawen A.The mitochondrial membrane potential(Δψm) in apoptosis，an update〔J〕.Apoptosis，2003；8(2)：115-28.

7Fariss MW,Chan CB，Patel M，etal.Role of mitochondria in toxic oxidative stress〔J〕.Mol Interv，2005；5(2)：94-11.

8Tarozzi A，Angeloni C，Malaguti M，etal.Sulforaphane as a potential protective phytochemical against neurodegenerative diseases〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2013;2013：415078.

9叶海燕，陈 勤.远志皂苷对Aβ1-40 诱导的AD 大鼠学习记忆功能障碍的保护作用机制研究〔J〕.中国新药杂志，2013；22(22)：2674-8.

〔2017-02-28修回〕

(编辑 郭 菁)

ProtectiveeffectofsengeninonhippocampusneuronalmitochondriaofAPP/PSIdoubletransgenicrat

SHUAIZhi-Feng,HANLi-Jun,GONGJian,etal.

PathologyDiagnosisCenterQiqiharMedicalUniversity,Qiqihaer161006,Heilongjiang,China

ObjectiveTo observe the regulation of the sengenin on APP/PSI double transgenic rats' hippocampus neuronal mitochondria, explore the protection of the sengenin to the nerves.MethodsAPP/PSI double transgenic rats were divided into model, sengenin high, middle and low dose groups(18.5, 37.0 and 74.0 mg·kg-1·d-1), the same month old C57BL/6 rats were chosen as the control group. Hippocampus neuronal mitochondria potential was detected by immunofluorescence, cell apoptotic rate was measured by flow cytometry, SOD, GSH-PX activity and MDA content were detected by colorimetry.ResultsCompared with control group, mitochondrial membrane potential was decreased, the apoptotic rate of neuron cell was increased, the activity of SOD，CAT and GSH-PX were decreased significantly, the content of MDA of model group was increased significantly. Compared to model group, the mitochondrial membrane potential was increased, the apoptotic rate of neuron cell was decreased, the activity of SOD, CAT and GSH-PX were increased, the content of MDA was decreased significantly in each sengenin group (allPlt;0.05).ConclusionsSengenin could protect the function of hippocampal neurons by regulating mitochondria function.

Sengenin; APP/PS1; Mitochondrion

R745.1

A

1005-9202(2017)22-5493-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.004

国家自然科学基金青年项目(No.81403131)；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2015107)

董海影(1982-)，女，博士，讲师，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

帅智峰(1982-)，女，硕士，讲师，主要从事神经精神疾病的病理学研究。