基于高内涵分析的甘草炮制雷公藤减毒作用研究△

马致洁，董捷鸣，王伽伯，庞晶瑶，3*，浦仕彪

(1.首都医科大学 附属北京友谊医院，北京 100050；2.解放军302医院 全军中药研究所，北京 100039；3.首都医科大学 附属北京潞河医院药剂科，北京 101149；4.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650200)

基于高内涵分析的甘草炮制雷公藤减毒作用研究△

马致洁1，董捷鸣1，王伽伯2，庞晶瑶1，3*，浦仕彪4*

(1.首都医科大学 附属北京友谊医院，北京 100050；2.解放军302医院 全军中药研究所，北京 100039；3.首都医科大学 附属北京潞河医院药剂科，北京 101149；4.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650200)

目的在体外L02肝细胞模型上观察甘草炮制雷公藤的减毒效果，为研究雷公藤低毒饮片提供依据。方法采用高内涵分析技术，检测细胞存活情况，比较甘草炮制雷公藤和配伍雷公藤的减毒差异。结果雷公藤对肝细胞的损伤呈剂量依赖性，在IC50的剂量下，甘草炮制雷公藤和甘草配伍雷公藤都有显著的减毒效果。结论采用高内涵分析方法更加直观、具体地反映了甘草炮制雷公藤的减毒效果，为临床安全用药提供参考。

雷公藤；甘草；炮制减毒；高内涵分析

雷公藤始载于《神农本草经》，具有祛风除湿、通络止痛、解毒杀虫等功效。现代药理研究表明雷公藤具有抗炎、杀菌、解热镇痛及多种免疫调节功能。因雷公藤毒性较大，传统方法外用较多，直至1974年首次将其内服用于治疗类风湿性关节炎，并取得良好的疗效。国内外大量基础研究和临床大规模、随机、双盲的前瞻性试验均证实，雷公藤是迄今为止治疗某些自身免疫性疾病疗效最为确切的一味中药[1-3]，几乎没有其他中药可以替代。但常见的肝肾毒性严重制约着其临床应用，因此开展雷公藤减毒新方法的研究具有重要的现实意义。

中医理论认为炮制是缓解药物毒性的有效措施之一，但雷公藤炮制方法鲜有古籍文献记载，且目前常用的炮制方法减毒效果不佳。近年来对其研究主要集中在配伍减毒增效方面[4-6]，配伍甘草减毒的应用已具有较好的实验和临床基础[7-9]，并且有学者对其主要成分进行结构修饰以期达到存效减毒的目的。

如法炮制是降低中药毒性的重要方法，加辅料是毒性中药炮制的常用方法，液体辅料常用到的有酒、醋、蜂蜜、姜汁以及甘草汁等，其中甘草性平、味甘，具有补脾益气，可调节药性，缓急解毒，历代医书对甘草解毒也广为记载和流传。但甘草作为保肝、护肝的常用解毒中药，却很少见其应用于具有肝毒性中药的炮制。因此本课题组在中医理论的指导下，拟从中药炮制减毒的角度入手，采用甘草汁炮制雷公藤，在L02肝细胞模型上，借助高内涵分析方法，评价甘草汁炮制雷公藤的减毒效果，为开展雷公藤炮制减毒的相关研究提供基础，同时也为雷公藤的临床合理应用提供参考。

1 材料和仪器

1.1 试剂和药物

RPMI1640完全培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)，(Gibco公司)，96孔板(Costar 3599，康宁公司)，锡箔纸，除菌滤器(25 mm，0.22 μm)，细胞培养瓶(430720，康宁公司)，Hochest 33342(H3570，生命科学)，SYTOX©Orange Nucleic Acid Stain(S11368，生命科学)。

对乙酰氨基酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100018-201409)；甘草由北京友谊医院中药房提供(批号：SAA11；产地：内蒙古)；雷公藤药材，采自福建三明，经首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科赵奎君主任药师鉴定为卫矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.F.的干燥根。

1.2 仪器

高内涵筛选系统(ImageXpress Micro XL，Molecular Devices公司)，常规倒置显微镜(上海泽权仪器设备有限公司)，恒温二氧化碳培养箱(NAPCO公司)，TC10TM自动细胞计数器(Bio-Rad公司)，台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司)，KQ5200E超声提取清洗器、LGJ-18型冷冻干燥机(北京西四环科学仪器厂)，SN510C高压蒸气灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司)。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 雷公藤药材提取方法 称取600 g雷公藤生药材，打粉机打碎成粗颗粒状。8倍体积(4800 mL)60%的乙醇水浸泡12 h后，超声提取3次，每次45 min，过滤，合并3次滤液。滤液于旋转蒸发仪浓缩至一定体积后冷冻干燥成粉末，备用。

2.1.2 甘草配伍雷公藤制备方法 称取已粉碎的雷公藤药材粗颗粒600 g，生甘草片200 g，置于同一容器。6400 mL溶剂中浸泡12 h后，超声提取3次，每次45 min，过滤，合并3次滤液。滤液于旋转蒸发仪浓缩至一定体积后，冷冻干燥成粉末，备用。

2.1.3 甘草汁炮制雷公藤制备方法 称取雷公藤生药材600 g(打粉机打碎成粗颗粒状)及生甘草饮片200 g。

2.1.3.1 甘草汁制备方法 8倍体积的纯净水(1600 mL)浸泡甘草饮片30 min，煎煮20 min，煎煮液滤出，相同步骤重复煎煮两次后合并滤液，浓缩至合适体积(约200 mL需能完全浸泡雷公藤)，备用。

2.1.3.2 甘草汁炮制雷公藤方法 用上述所得甘草汁浸泡雷公藤30 min，待甘草汁基本被雷公藤药材吸尽；于恒温100 ℃炒10 min至雷公藤药材表面不粘手，得雷公藤炮制品。

2.1.3.3 雷公藤炮制样品的提取方法 取上述制得的雷公藤炮制品，按照2.1.1项下雷公藤药材提取制备方法，制得雷公藤炮制品的供试样品。

2.2 正常人肝L02细胞的细胞毒性评价方法

正常人肝L02细胞，在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100 μg·mL-1的链霉素的培养基中，37 ℃、5% CO2条件下进行常规培养，实验均在细胞生长对数期进行。细胞均匀接种在96孔板中，每孔5000个细胞，铺板24 h后给药(由于雷公藤提取物不易溶于水，每孔细胞加入0.1%的DMSO助溶)，待给药24 h后进行荧光染色。本实验采用二重荧光标记法，用浓度为1 μmol·L-1的SYTOX©Orange Nucleic Acid Stain(Abs/Em：547/570 nm)标记死细胞的细胞核显橙色，用质量浓度为1 μg·mL的Hochest 33342(Ex/Em：350/461 nm)标记所有细胞的细胞核显蓝色，于37 ℃避光孵育15 min后，由高内涵仪器直接对细胞进行成像分析。统计结果，并分析各孔的细胞存活情况。

2.3 统计方法

用ImageXpress Micro XL高内涵软件对图像进行分析处理，实验数据以GraphPad Prism 5.0、OriginPro 8.5、IBM SPSS Statistics 20软件处理，所有数据均采用独立样本t检验进行统计学分析，设P<0.05具有统计学差异。

3 结果

3.1 雷公藤提取物对正常人肝L02细胞的毒性分析及其IC50值

本实验设10个质量浓度梯度(C1～C10)，分别为12、9、6、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg·mL-1，最高质量浓度为12 mg·mL-1，用ImageXpress Micro XL高内涵仪器，采用二重荧光标记法(Hochest 33342标记所有的细胞，SYTOX©Orange Nucleic Acid Stain标记死细胞)，以每孔活细胞的百分比作为评价指标，用GraphPad Prism 5.0软件处理，结果lgIC50值为-0.127 3，计算IC50值为0.746 mg·mL-1(约0.75 mg·mL-1)，见图1。

图1 雷公藤提取物作用于肝L02细胞的IC50值

3.2 雷公藤配伍甘草对肝细胞减毒作用的比例筛选

为进一步筛选甘草减弱雷公藤对肝细胞毒性作用的适宜配比，本实验采用0.75 mg·mL-1雷公藤与不同质量浓度(0.25、0.125、0.083 mg·mL-1)的甘草进行配伍，雷公藤与甘草的比例分别是3∶1，6∶1，9∶1，比较雷公藤单用(0.75 mg·mL-1)及与甘草不同配伍比例(3∶1，6∶1，9∶1)对细胞的抑制效果。图2结果显示，3∶1与6∶1的比例在肝细胞体外实验上都能达到有效的减毒效果。但考虑到甘草在体内的首过效应等问题，为保证体内减毒效果，故选择较大的甘草的比例[雷公藤-甘草(3∶1)]进行后续实验研究。

注：*P<0.05,下同。图2 雷公藤与甘草不同配伍比例样品的细胞抑制率

3.3 高内涵分析方法评价雷公藤不同样品作用于肝细胞的毒性情况

实验取雷公藤对肝细胞毒性的IC50值为0.75 mg·mL-1，对乙酰氨基酚3 mg·mL-1作为肝细胞毒性的阳性对照，甘草与雷公藤的配伍比例为1∶3，甘草炮制雷公藤用药比例为1∶3，分析比较雷公藤单用、甘草炮制雷公藤、雷公藤配伍甘草作用于细胞的毒性差异。

配制高质量浓度的雷公藤溶液，稀释为0.75 mg·mL-1(含0.1%的DMSO)，配制含等浓度雷公藤的甘草汁炮制品(雷公藤炮品)和雷公藤配伍甘草的样品(雷公藤配品)，稀释的终浓度样品同样含有0.1%的DMSO，阳性对照和空白对照也加入0.1%的DMSO。将各样品均匀加入到预先种好的细胞中，复6孔，24 h后染色分析。用ImageXpress Micro XL高内涵仪器分析，采用二重荧光标记法(Hochest 33342标记所有细胞显蓝色，SYTOX©Orange Nucleic Acid Stain标记死细胞显橙色)，以细胞抑制率作为评价指标，用OriginPro 8.5软件作图。

图3 高内涵染色技术分析雷公藤不同样品对肝细胞的作用

从图3细胞核染色情况来看，阳性对照组与雷公藤组的细胞毒性作用较大，死细胞数目较多，而雷公藤炮制品与配品的死细胞数目相对较少，细胞毒性较小。由图4的细胞抑制率更能准确反映出对乙酰氨基酚和雷公藤对细胞的毒性作用之大，同时反映出甘草炮制雷公藤可有效减低肝细胞的毒性，其减毒效果与雷公藤配伍甘草相当，且P<0.05，差异具有统计学意义。

图4 雷公藤不同样品的细胞抑制率

4 讨论

研究结果显示，在细胞水平上，甘草汁炮制雷公藤与雷公藤配伍甘草两种方法都能有效降低雷公藤对肝细胞的毒性作用，且甘草汁炮制的雷公藤更便于临床应用，为以后开发雷公藤的低毒饮片奠定基础。

本研究选择人正常肝细胞系L02细胞，结合高内涵分析技术评价甘草炮制雷公藤的减毒效果。高内涵分析技术是近几年发展起来的新药筛选技术，该技术在保留了高通量能力的基础上，不再是在分子水平针对某种单一靶标进行的筛选，而是在细胞水平针对生物体内多系统、多途径、多种靶标进行的实施动态筛选，提供了细胞水平全方位的检测平台，为药物毒理学研究提供了高效的使用工具[10]。

并且该技术已广泛用于新药研发的早期筛选、毒性评价及毒性机制的研究等方面[11]。本实验利用其高通量、直观动态监测的优势，尝试对甘草炮制雷公藤减毒作用进行早期评估，研究结果显示甘草炮制雷公藤能有效降低雷公藤对肝细胞的毒性，为后续深入研究提供参考。后期课题组将在此基础上开展甘草炮制雷公藤减毒的体内效果评价及机制研究，为雷公藤的临床合理用药提供科学依据。

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CompatibilityAttenuatedResearchofGlycyrrhizaConcoctedTripterygiumwilfordiiBasedonHighContentAnalysis

MAZhijie1，DONGJieming1，WANGJiabo2，PANGJingyao1，3*，PUShibiao4*

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.ChinaMilitaryInstituteofChineseMedicine，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.DepartmentofPharmacy，BeijingLuheHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing101149，China；4.TraditionalChineseMedicineCollegeYunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：To observe the compatibility attenuated effect ofGlycyrrhizaconcoctedTripterygiumwilfordiion L02 hepatocyte modelinvitro，and provide the basis for the study ofT.wilfordiilow toxicity decoction pieces.MethodsThe effects of concocted attenuating and compatibility attenuated ofGlycyrrhizaandT.wilfordiiwere compared by using High Content Analysis technology.ResultsA dose dependent relation existed betweenT.wilfordiiand hepatic cells injury，that bothGlycyrrhizaconcoctedT.wilfordiiandGlycyrrhizacompatibilityT.wilfordiihad a significant attenuated effect under the dose of IC50.ConclusionConcocting attenuated effect ofGlycyrrhizaandTripterygiumwilfordiiwas specifically reflected through High Content Analysis technology，the results provide reference for clinical safe drug use.

Tripterygiumwilfordii；Glycyrrhiza；concocting attenuated；High Content Analysis

首都卫生发展科研专项(首发2016-4-2024)；北京市医院管理局“青苗”人才培养计划项目(QMI20160106)；北京友谊医院院启动项目(YYDQKT2014-20)

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庞晶瑶，临床药师，研究方向：中药药理，E-mail: pjy101411@163.com；浦仕彪,博士，副教授，研究方向：肝病的中医诊疗研究，E-mail: pushi511@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.013

2017-01-12)