基于系统药理学探索痛泻要方治疗肠易激综合征的分子机制△

缪乐涛，张婧娴，芮俊乾，陈逸凡，杨星昊

(南京师范大学 生命科学学院，新药研究中心，江苏 南京 210023)

基于系统药理学探索痛泻要方治疗肠易激综合征的分子机制△

缪乐涛，张婧娴，芮俊乾，陈逸凡，杨星昊*

(南京师范大学 生命科学学院，新药研究中心，江苏 南京 210023)

目的建立痛泻要方治疗肠易激综合征(IBS)的“化合物-靶点-通路”的网络，研究其多成分、多靶点、多途径的作用机制。方法利用TCMSP数据库为基础查找痛泻要方的化学成分，利用Drug Bank数据库检索作用靶点，构建药物-成分-靶点数据库；在PubMed Gene数据库中检索疾病相关基因，通过 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对获取的靶点进行相关通路分析，利用Cytoscape软件构建痛泄要方的“化合物-靶点-通路-疾病”网络图。结果获得痛泻要方中有效成分42种，相关作用靶点18个，涉及35条信号通路。结论痛泻要方可能通过作用于免疫、炎症、内分泌系统的相关蛋白靶点及通路，起到治疗IBS的作用。

痛泻要方；肠易激综合征；系统药理学；作用机制

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)为消化道常见的一种功能性疾病，其主要症状为腹部不适和(或)疼痛及慢性间隙性排便习惯和大便性状的改变，有时伴随机体其他各个系统的变化。欧美国家患病率约为10%～15%，大部分亚洲国家的IBS流行率在0.8%～10%[1]。随着经济发展，人们的生活节奏加快，我国该类疾病发病率日益上升。肠易激综合征发病机制至今尚未完全阐明，目前认为主要与肠道动力异常、内脏感觉异常、神经-免疫-内分泌异常并与精神、心理因素等相关，被公认为临床常见的难治疾病。

痛泻要方始载于《景岳全书》，原方由白术、白芍、陈皮和防风组成，有补脾泻肝之功用。据统计分析，痛泄要方是临床最常用的基础方，多数临床有效方均从痛泄要方衍变而来，经痛泻要方治疗后腹泻型IBS患者的各症状积分、症状总积分(腹痛或腹部不适、大便次数、大便性状异常、黏液便)显著改善，临床治疗肠易激综合征具有安全有效的优势[2]。实验研究表明，痛泻要方能调节体内外肠肌运动紊乱、促进小肠吸收功能、降低内脏高敏感大鼠肠道敏感性、抑制应激腹泻大鼠排便次数、减少粪便含水量、降低结肠动力[3]；对小鼠小肠推进功能亢进模型及小肠推进功能抑制模型具有双向调节作用[4]。进一步研究发现，痛泻要方降低模型大鼠脑内和肠道组织中5-羟色胺(5-HT)水平、调节5-HT受体表达，减弱背角神经元兴奋性，从而提高内脏痛阈、消除肠道高敏感[5]。对P物质(SP)、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、胰高血糖素样肽、生长抑素等胃肠激素具有显著调节作用[6]。我们课题组前期从痛泄要方乙醇提取物中鉴定23种不同类型成分，重点研究痛泄要方血脑成分谱中11种药代标记物的大鼠血液、脑组织、尿液中代谢趋势，初步阐明痛泄要方中一些重要化学成分在大鼠体内吸收、代谢、转化的规律[7-8]。以上研究表明，痛泻要方具有多成分、多靶点、多途径的特点。虽然目前对痛泻要方的研究逐年深入，但针对痛泄要方治疗IBS的作用机制研究仍不够系统和全面。

近年来，系统药理学的概念随着计算机技术、基因组学、蛋白质组学、代谢组学、生物信息学等理论的发展应运而生。系统药理学是从分子、网络、细胞到组织、器官、个体乃至群体等不同层次的系统水平研究药物与机体相互作用及其规律、作用机制的一门新兴学科，研究药物治疗疾病时引起机体功能变化的机制，建立药物对机体作用的相互作用网络，并通过网络分析，系统地阐述药物多分子对疾病的协同作用[9]。中药复方是多组分、多靶点及其组分间协同作用的复杂体系，使得中药的深入研究呈现巨大困难。系统药理学提供了从整体水平研究中药复方的思路和方法，在中药活性组分筛选、系统靶标发现、中药配伍理论研究、作用机制阐明等方面已显示了良好的应用前景[10]。

本文尝试应用系统药理学的方法对痛泻要方治疗IBS的作用机制进行探索，构建其“药物-化合物-靶点”的网络药理图，获得相关通路并对其进行分析，为后续实验研究提供理论依据。

1 材料

TCMSP数据库，Drug bank数据库，NIH 基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)，Cytoscape2.6.0软件，DAVID分析工具，UniProt KB数据库，京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路数据库。

2 方法

实验研究思路示意图见图1。

图1 痛泻要方治疗IBS作用机制的系统药理学研究思路

2.1 肠易激综合征相关基因的检索

以肠易激综合征(irritable bowel syndrome)为关键词，从美国国家卫生研究所(national institutes of health，NIH)基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /gene)中查找肠易激综合征的相关基因(检索日期为2016年10月8日)。

2.2 痛泻要方中药材的化学成分及对应靶点的检索

以白术、防风、白芍、陈皮为检索词，从TCMSP数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)中检索相应化学成分[11]，并导入Drug Bank数据库获得相应作用靶点，并通过UniProt KB数据库核对，所获得的作用靶点包括这些天然化学成分直接作用或间接影响的蛋白分子。

TCMSP是中药药物研究平台及数据库，囊括了2015年版《中华人民共和国药典》收录的全部中药材的组分数据，包括13 144个分子及29 384个化合物，涵盖了每个化合物的吸收、分布、代谢、排泄、毒性参数及类药性参数。

DrugBank数据库是世界上最主流的药物数据库之一，包括已知的3000多种药物的化学、药理学、医学以及分子生物学信息，还包括4100种已经获准或正在实验中的药物产品。

2.3 相关通路的注释分析

将检索获得的基因及蛋白导入DAVID聚集化分析工具中，设置参数，Select Identifier：OFFICIAL-GENE-SYMBOL；List Type：Gene List。进行富集化分析和 KEGG 通路注释分析，靶点富集的通路被认为是药物调控的通路。

DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)是一个生物信息数据库网址(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)，它整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表(成百上千个基因ID或者蛋白ID列表)提供系统综合的生物功能注释信息，帮助用户从中提取生物学信息[12]。

2.4 痛泻要方“有效成分-靶点”以及“基因-通路”网络构建

以药物的有效成分以及作用于IBS的预测靶点为节点(node)，分别在Excel表格中构建彼此相应的关系，导入Cytoscape2.6.0软件，用Network Analyzer插件构建“有效成分-靶点”以及“基因-通路”的网络图。若其中某一靶点为某一化合物的潜在作用靶点，则二者以边(edge)连接。若通路中有参与调节的靶点，则把通路与靶点以边(edge)连接，以此构建“有效成分-靶点”以及“基因-通路”网络图。

3 结果

3.1 与IBS相关的基因

截止2016年10月8日，在基因数据库中总共获得67种与IBS相关的基因以及与之相对应的人源蛋白。

3.2 所含化合物及其靶点的收集与处理

通过TCMSP数据库从痛泻要方中检索到376个小分子化合物。其中白芍85个、防风173个、白术55个、陈皮63个，导入Drug bank数据库，可获得990、1931、773、479相关靶蛋白。去除一些重复的成分及靶点，初步构建351种化学成分，3977个靶蛋白数据库。在获得的药物-成分-靶点的数据库中进行筛选，发现共有18个与IBS治疗相关的靶点，见表1。在数据库中对这18个靶点起作用的有效成分共有42种，见表2。

表1 痛泻要方调控IBS的靶点

表2 痛泻要方调节相关靶点的有效成分

表2(续)

对筛选获得的靶点分析发现，IL-10、IL-1B、IL-4、IL-6、TNF与体内炎症免疫反应相关；SLC6A4、HTR3A、HTR2A、CRF等与内分泌调节相关；BDNF与神经细胞生长调节相关。

对中药有效成分分析发现，这些成分包括黄酮类(柚皮苷Naringin、山柰酚Kaempherol、汉黄芩素Wogonin、川陈皮素Nobiletin)、萜类(芍药苷Paeoniflorin)、内酯类(白术内酯I Atractylenolide-1、白术内酯III Atractylenolide-3)、香豆素类(秦皮素fraxetin、补骨脂素Psoralen、紫花前胡苷Nodakenin、蛇床子素osthol)、酚类(香兰素Vanillin)、草烯alpha-humulene、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、胡萝卜苷beta-sitosterol、挥发性成分[萜品醇Terpineol、苍术酮(5E，9Z)-3，6，10-trimethyl-4，7，8，11-tetrahydrocyclodeca[b]furan]和脂肪酸类(十八烯酸Oleic acid)等。

3.3 痛泻要方潜在靶点的通路注释及分析

将预测出的靶点通过DAVID 6.9工具及KEGG数据库进行通路分析，共找到35条与IBS相关的通路，见表3。这35条通路中，其中与炎症免疫相关的通路共有30条；与内分泌神经系统相关的通路共有5条。

3.4 “有效成分-靶点”以及“基因-通路”网络结果

运用Cytoscape2.6.0软件构建“有效成分-靶点”以及“基因-通路”网络结果，见图2、3。

4 讨论

通过对痛泄要方“化合物-靶点-通路”前文网络进行分析发现，痛泻要方中调控IBS基因的42种有效成分主要包括黄酮类、香豆素类、萜类、色原酮类、挥发性成分(烯类、醇类、芳香酚类、有机酸类、醛类)，这些成分既有共同的作用靶点群及通路群，又各有偏重，各通路群间通过共有靶点连接，显示出不同成分间的多靶点协同作用。体现出复方多成分、多靶点、多通路整合调节的作用特点。

使用MAS3.0软件对作用靶点进行GO分析，获得靶点的具体功能，见表4。GO分析从分子功能、生物过程以及细胞组分三方面对调控靶点进行分析。这里以P值为参数，选择排名前五的功能进行讨论。可以很明显地看出，分子功能中以细胞因子5-羟色胺受体激素作用为主，而生物过程中则以炎症应答为主。这说明痛泻要方主要通过对5-羟色胺受体等激素以及体内炎症应答反应的调控，从而治疗肠易激综合征。

图2 药物-成分-靶点

图3 痛泻要方调控IBS的信号通路

表4 靶点的GO分析

另外，网络分析显示，有关靶点所涉及的通路大致可以分为两类，痛泻要方可能通过对这两类通路的调节发挥其治疗作用。

第一类免疫和炎症相关信号通路，以T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、Toll样受体信号通路(TLRs，Toll-like Receptors Pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)等为代表，主要由c-FOS、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶(MMP9)等分子参与调节。近年来，临床发现，IBS病人不同程度存在肠道低度炎症、免疫激活、黏膜屏障功能降低。实验研究发现，IBS病人免疫细胞(肠道肥大细胞)及细胞因子(IL-1)异常。Halvorson等[13]通过Meta分析认为感染性胃肠炎患者是正常人群患IBS概率的7倍，其机制可能与病原微生物侵入肠道后导致炎症细胞趋化及免疫细胞的激活，并释放多种介质如TNF、IL、组胺、类胰蛋白酶等，破坏肠黏膜屏障，增加了肠黏膜的通透性，最终导致IBS的发生。从网络分析结果来看，黄酮类(柚皮苷、山柰酚、汉黄芩素、川陈皮素)、萜类(芍药苷)、内酯类(白术内酯I、白术内酯III)、香豆素(秦皮素)、酚类(香兰素)、草烯能够与白细胞介素-2、TNF、MMP9等蛋白作用，通过调节多条炎症相关通路来降低体内炎性因子的含量，发挥其抗炎作用。据文献报道，白术内酯Ⅰ可作用于TLR4，对小鼠腹腔巨噬细胞有抑制作用，并通过抑制NF-κB p65的核转位，而抑制TNF-α和NO产生，发挥抗炎作用[14]。草烯通过对NO以及IL-1等细胞因子的调控具备抗溃疡以及抗炎功效[15]。Qian等发现[16]，芍药总苷通过阻断Toll样受体4/5信号通路，抑制树突状细胞的功能，从而减轻了免疫介导的炎症反应，这些实验结果与本文预测结果相一致。

第二类神经和内分泌系统相关通路，包括丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、Hepatitis B、Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Serotonergic synapse。其中，脑源性神经营养因子(BNDF)能够调控神经细胞的生长、生存、分化和凋亡，保护由于应激引起的神经元损伤，维持神经系统的正常功能。脂肪细胞因子(ADIPOQ)是脂肪细胞特异性分泌的一种细胞因子，能够调控生物体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢，参与调节肝脏肠道功能。促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)与特异性受体结合可调节结肠运动、结肠扩张及内脏疼痛敏感性，辣椒素受体(TRPV1)是分布于伤害性感觉神经元的非选择性阳离子通道，在胃肠道的感觉神经纤维及相应背根神经节上有广泛表达，并参与内脏高敏感性及胃肠动力的改变，与多种功能性或器质性疾病(如功能性消化不良、肠易激综合征、消化性溃疡、炎症性肠病等)存在密切联系[17]。5-羟色胺受体(HTR2A，HTR3A)、5-羟色胺转运体(SLC6A4)是5-HT信号通路的主要构成元件。在5-HT的合成、释放、与受体结合及重摄取等的信号转导过程中，任一环节发生异常均有可能导致胃肠道动力、分泌功能改变和内脏高敏感的产生[18]。从网络分析结果来看，黄酮类(柚皮素)、内酯类(白术内酯I、白术内酯III、香豆素类(补骨脂素、紫花前胡苷、蛇床子素)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、胡萝卜苷、挥发性成分(萜品醇、苍术酮)和脂肪酸(十八烯酸)能够与CRH、转化生长因子β1、脑源性神经营养因子、脂肪细胞因子、SLC6A4、HTR2A，HTR3A等蛋白分子作用，通过调节神经或内分泌系统相关通路来影响内脏感觉传递和胃肠功能。内脏高敏感和胃肠功能紊乱是IBS的主要致病机制。文献报道，痛泻要方能够降低结肠局部的5-HT、SP含量，并减弱背角神经元兴奋性，提高内脏痛阈、消除肠道过敏[19]。白术内酯增强唾液淀粉酶活性，促进肠管吸收，调节肠道功能[20]。本课题组前期的研究表明，痛泻要方中有效成分对IBS模型大鼠 5-HT信号通路的多个关键环节的蛋白水平和mRNA水平都有显著的调节纠偏作用(结果即将发表)。这些实验结果验证了本研究的预测结果。

本研究结果显示，痛泄要方中黄酮类、香豆素类、萜类等有效成分通过作用于c-FOS、IL、TNF、MMP9、CRH、转化生长因子β1、脑源性神经营养因子、脂肪细胞因子、SLC6A4、HTR2A、HTR3A等多个靶点，从而调控机体免疫、内分泌及神经系统的相关通路发挥治疗作用。本研究初步揭示了痛泄要方治疗肠易激综合征的多维调控网络，为深入研究痛泄要方的作用机制提供了思路。

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NetworkPharmacology-basedStudyonMechanismofTONGXIEYAOFANGinTreatmentofIrritableBowelSyndrome

MIAOLetao，ZHANGJingxian，RUIJunqian，CHENYifan，YANGXinghao*

(CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity，Nanjing210023，China)

Objective：To establish the network of “compound-target-pathway” in the treatment of irritable bowel syndrome(IBS)in Tongxieyaofang，and study its multi-component，multi-target and multi-path mechanism.MethodsThe drug-constituent-target database was constructed by using the Drug Bank database，and the disease-related genes were searched in the PubMed Gene database.The genes of the disease-related genes were searched by the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG database was used to analyze the acquired pathways，and Cytoscape software was used to construct the “compound-target-pathway-disease” network.ResultsThere were 42 effective components in pain-relieving recipe and 18 related-related targets，involving 35 signal pathways.ConclusionTongxieyaofang may play a role in the treatment of IBS through the role of immune，inflammation，endocrine system related protein targets and pathways.

TONGXIEYAOFANG；irritable bowel syndrome；network pharmacology；molecular mechanism

江苏省高校自然科学研究重大项目(15KJA360001)

*

杨星昊，博士，教授，研究方向：E-mail：yangxinh@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.012

2017-04-10)