贝类生物毒素研究进展

阮 雯， 纪炜炜， 岳冬冬， 方 海， 刘 勤, 王鲁军， 王 芸, 张晓峰， 陆亚男

(农业部远洋与极地渔业创新重点实验室，中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090)

贝类生物毒素研究进展

阮 雯， 纪炜炜， 岳冬冬， 方 海， 刘 勤, 王鲁军， 王 芸, 张晓峰， 陆亚男*

(农业部远洋与极地渔业创新重点实验室，中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090)

贝类是广受欢迎的水产品，但贝类中的生物毒素常引起食品安全事故，严重威胁消费者健康，影响了海洋养殖业的可持续发展。本文阐述了常见贝类毒素的种类如记忆缺失性贝毒、麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、神经性贝毒、原多甲藻酸贝毒和环亚胺类贝毒，进一步综述了其毒素来源及分布区域，并简单介绍了贝类毒素的两种分析检测方法，最后介绍了发达国家和组织对贝类毒素的监控限量，以期为我国贝毒的监测和标准设定提供参考。

贝类生物毒素； 来源； 分布； 检测方法； 限量标准

贝类是广受市场欢迎的水产品，贝类养殖是水产业的支柱产业之一。我国是世界上最大的贝类养殖国，贝类养殖始于20世纪70年代，贝类年产量占世界贝类总年产量的60%以上。据统计，2015年我国贝类总产量为1 384.6×104t，比2000年增长33.27%，占水产养殖总量的28%，其中主要为海水贝类养殖，年产量为1 358.8×104t[1]。中国现有海水养殖贝类品种约20多个，主要为贻贝、扇贝、牡蛎、螠蛏、鲍鱼、文蛤等[1]。

贝类属于非选择性滤食生物，其食物主要为藻类、原生动物等浮游生物和一些有机物残渣。在其生长过程中极易富集环境中的有害物质，如致病菌、贝类毒素、农药残留物、重金属等。若卫生管控不当，食用后会对人体健康产生危害，甚至引起中毒，对消费者的生命构成威胁。因食用贝类导致的中毒事件时有发生。贝类中毒事件的最主要诱因是贝类通过不同方式积累的生物毒素，其中不同类型的藻类毒素和河豚毒素是比较常见的外源毒素[2]。为了捕食和防御外敌，部分贝类自身也能产生毒素，但随着人们食用贝类的经验积累，基本能对此类贝类进行鉴别，因此由于贝类自身的内源性毒素造成的中毒事件并不多见。大规模的贝类中毒事件多是因为贝类通过食物链或其它原因累积的外源性毒素造成[2]。贝类生物毒素不仅对消费者的健康造成了威胁，也影响了水产养殖业的可持续发展。随着研究的深入和检测仪器设备的完善，人们对贝类生物毒素的了解越来越深刻，一些新的毒素类型也陆续被发现，提高了对贝类食品安全的认识水平。

1 贝毒的种类、来源及分布

1.1记忆缺失性贝毒(Amnesicshellfishpoisoning,ASP)

记忆缺失性贝毒于1987年在加拿大一次大规模中毒事件中第一次被发现，中毒病人的典型症状为腹痛、腹泻、呕吐、短暂记忆缺失、意识混乱，不能辨认家人及朋友，多数在进食后3～6小时发病，因其导致记忆缺失的中毒症状奇特而命名。经研究，记忆缺失性贝毒的主要成分为软骨藻酸，属氨基酸类化合物，分子式为C15H21NO6，相对分子质量为311.33，易溶于水，是由长链羽状硅藻代谢产生的一种强烈的神经毒性物质，可直接或间接刺激谷氨酸受体。软骨藻酸含有三个羧基和一个仲氨基，在不同pH条件下，可呈现不同带电状态[3]。软骨藻酸具有十多种异构体，推测是由软骨藻酸在一定条件下转化而来。

软骨藻酸于1958年由日本科学家在鹿儿岛的大型藻类软骨藻中分离得到，常被用作驱虫剂。1975年在地中海红藻中也分离出软骨藻酸。1987年加拿大中毒事件后，进一步研究发现软骨藻酸的产生藻为多列拟菱形藻Pseudo-nitzschiamultiseries，随后发现拟菱形藻属中的澳洲拟菱形藻P.australis，成列拟菱形藻P.seriata和菱形藻属的Nitzschiaactydrophila以及人工养殖的双眉藻属的咖啡形双眉藻Amphoracoffaeiformis也可产生软骨藻酸，特别是拟菱形藻属和菱形藻属中的海洋硅藻大量繁殖形成赤潮后的初始阶段软骨藻酸产量较高，可见软骨藻酸是与赤潮发生密切相关的一种生物毒素[3]。不同藻种软骨藻酸的产生情况差异较大，且受温度、盐度等多种因素的影响，目前具体作用机制尚不明确。

拟菱形藻广泛分布于全球海水中，主要有毒藻种的分布如表1。目前我国也有一些关于能产毒的拟菱形藻的报道，但具体产毒情况尚无报道。

1.2麻痹性贝毒(Paralyticshellfishpoisoning,PSP)

麻痹性贝毒是目前世界范围内分布最广、危害最大的一类赤潮生物毒素。PSP中毒初期为口舌感觉异常、麻木，恶心眩晕，而后可出现身体部位麻痹，严重时可致呼吸困难、喉咙紧张，危险期为12～14小时。PSP不易诊断，一般根据进食史判断。研究表明PSP来源于海水中的有毒甲藻。PSP一系列毒素的化学结构在1957年由石房蛤中所分离出的石房蛤毒素Saxitoxin(STX)首次确认[4]。

PSP是一类四氢嘌呤的三环化合物，胍类毒素，易溶于水。目前已发现的PSP多达23种，根据取代基的不同进行分类。其C11上存在同分异构现象，在贝类体内，β异构体可以转化成更加稳定的α异构体，其摩尔比(α/β)可以用来分析贝类的染毒时间[3-4]。根据基团的相似性，麻痹性贝毒可分为四类：氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(Neosaxitoxin，NEO)，膝沟藻毒素GTX1-4；N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括C1-4、GTX5(B1)和GTX6(B2)；脱氨甲酰基类毒素(Decarbamoyl toxins)，包括dcSTX、 dcneoSTX、dcGTX1-4；脱氧脱氨甲酰基类毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)[4]。关于PSP的研究主要集中在对石房蛤毒素的研究上。

PSP分布非常广泛，全球多国海域均有发现，包括日本、美国、加拿大、新西兰、澳大利亚、法国、智利、中国内地和台湾等海域都发生过PSP中毒事件，且其蔓延的趋势在进一步扩大。

表1 主要有毒拟菱形藻的分布区域Tab.1 Distribution of majorpoisoning Pseudo-nitzschia

1.3腹泻性贝毒(Diarrheicshellfishpoisoning,DSP)

腹泻性贝毒是一类脂溶性毒素，化学结构为聚醚或大环内酯化合物，不易溶于水，热稳定性高。主要包括软海绵酸(Okadaic acid,OA)、鳍藻毒素(Dinophysistoxin,DTX)、蛤毒素(Pecteno-toxins,PTX)、虾夷扇贝毒素(Yessotoxins, YTX)。大部分DSP 中毒的主要症状是腹泻、恶心、呕吐，可持续三四天，一般不致命。

OA是最早被发现的脂溶性毒素，1978年发现于产自日本海域的一种海绵。OA毒素和DTXs对蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A) 型的蛋白磷酸酶的抑制作用非常专一且高效[3]。其中OA还有明显的致癌作用，贝类产品肝脏中OA和DTX-1毒素的含量超过2 μg/g和1.8 μg/g，食用时就会对人类产生毒害作用。PTX和YTX均最初发现于日本的虾夷扇贝中[3-4]。PTX在贝类中常与OA毒素伴生，化学结构和OA类似[5]。主要产毒藻为鳍藻，目前已发现有15种组分。YTX是脂溶性贝毒中最复杂的一类毒素，同系物高达百种，主要存在于网状原甲藻和多边舌甲藻中，但YTX不具备腹泻性毒性[3]。

OA和DTX目前在全球几乎所有近岸海域均有分布，PTX主要分布在日本海岸，目前已扩展到澳大利亚、新西兰和一些欧洲国家，YTX也在世界多个地区的贝类中被检测出。目前腹泻性病毒在全球的分布仅次于麻痹性贝毒[5]。

1.4神经性贝毒(Neurotoxinshellfishpoisoning,NSP)

神经性贝毒也是一类脂溶性贝毒，主要产毒藻为短裸甲藻，海洋卡盾藻和赤潮异弯藻也能产生此类毒素。人类食用蓄积了短裸甲藻的贝类后一般30 min到3 h就会出现NSP中毒现象，主要表现为胃肠紊乱和神经麻痹，在赤潮区吸入含有短裸甲藻毒素的气雾也会引起气喘、咳嗽等中毒现象。NSP于1947年首先在墨西哥湾的短裸甲藻中发现，1981年从短裸甲藻中成功分离得到了短裸甲藻毒素，用闪光分析法将该毒素分为BTX-A,BTX-B,BTX-C三种，其主要毒素为BTX-A和BTX-B。目前已从短裸甲藻细胞提取液中分离出13种NSP毒素成分，其中11种成分的化学结构已确定[3]。新西兰的绿壳贻贝中分离出的新短裸甲藻毒素BTX-B3，其结构和生物活性与BTX-B极为相似，有同源的可能性。BTX毒素的主要分布范围为美洲墨西哥湾沿岸和新西兰豪拉基海湾，但目前其分布海域仍在扩散。

1.5AZA贝毒(Azaspiracid)

AZA贝毒最初是因为在1995年荷兰人因吃了在爱尔兰Killary港养殖的紫贻贝发生了中毒事件而受到关注，1996年被首次分离出[3]。AZA的中毒症状和腹泻性贝毒非常相似，但随后证明其不属于腹泻性贝毒，有其独特的化学结构和特性。AZA为一类含氮聚醚类毒素，热稳定性较好，常规烹饪和加工方法无法去除，毒性远强于OA，目前尚无有效药物可治疗[3]。已发现有32种同系物，主要产毒藻为原多甲藻。最早被AZA毒素污染的贝类主要来源于爱尔兰，目前已在英格兰、挪威、摩洛哥、加拿大、日本、智利及中国等沿海地区贝类中均有发现。

1.6环亚胺类毒素(Cyclicimine,CI)

CI贝毒是一类具亚胺和三螺环醚的大环化合物，它们具有相似的分子结构，主要包括SPX、PnTX、PtTX、GYM、prorocentrolide、spiro-prorocentrimine等。 SPX是其中最大的一类，最初于上世纪90年代于加拿大的扇贝和贻贝中发现，产毒藻是Alexandriumostenfeldii。PnTX首次发现于日本，后在欧洲、大洋洲部分地区也有发现。PtTX仅发现于日本的企鹅珍珠贝。GYM最初发现于新西兰的牡蛎中，主要产毒藻为Gymnodiniummokimotoi和G.selliforme。Prorocentrolide和spiro-prorocentrimine产毒藻为prorocentrum，在贝类中含量较低[3]。尽管在全球多个地区的贝类和藻类中都发现了CI毒素，但因其毒性和含量均较低，对人类的食用风险较小，大多国家并无针对CI的限量标准，但欧盟目前已对该毒素提出建议限制浓度，SPX1为100 μg/kg, GYM为200 μg/kg，PnTX-E为200 μg/kg, PnTX-F为200 μg/kg，PnTX-G为50 μg/kg[6]。

2 分析检测方法

目前已建立起的贝类毒素分析方法主要分为两大类：生物检测分析法和化学分析法。

2.1生物检测分析法

小鼠生物法是最普遍认可的常规检测方法，主要是通过对小鼠腹腔注射贝类提取物，然后观察小鼠的中毒症状和死亡时间等来判断毒性大小[7]。该法简单易掌握，但重现性较差且无特异性，无法提供具体的检出值，检测结果易受到多种因素的影响，准确度不是很高。在ASP和PSP检测中使用较多，因脂溶性贝毒常共存，因此在多个国家分析脂溶性贝毒方面，已逐渐被限制、减少使用，逐步被其它方法取代。

细胞毒性测试法是一种功能学体外细胞测试法，主要是根据贝毒与细胞膜上的敏感成分相互作用启动特异反应，根据细胞膜通透性的改变来进行细胞毒性的分析检测[8]。在脂溶性贝毒方面研究较多，如DSP、BTX、OA、CI。但有研究者认为其受到实验室、操作人员影响差异性交大，因此应用范围比较有限。

免疫分析法是利用特异性抗原-抗体结合来检测药物、激素、蛋白质等物质的定量分析法，有很高的灵敏度和特异性，且操作简单，在大批量现场样本分析上具有优势，是重点发展的贝毒分析法之一[7]。目前主要包括放射免疫法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)。在腹泻性贝毒中使用较为广泛，已有一些试剂盒用于BTX和OA。但该方法对酶制剂要求较高，且无法提供具体毒素的成分信息。

酶蛋白抑制法是基于贝毒抑制蛋白磷酸酶的酶活力的一种检测方法，主要用于腹泻性贝毒OA和DTX[9]。目前世界上很多国家已经建立了多个OA的免疫分析测试法。该方法需要活性较高的蛋白磷酸酶，且无法提供毒素的信息。

此外还有受体结合法和毛细电泳法。受体结合分析法是利用贝毒与相关细胞膜结合程度建立起来的毒素测试法。毛细电泳法则是利用毛细管电泳来分离毒素。这两种方法受限较多，前者目前主要用在BTX和CI上，后者主要用在腹泻性贝毒OA和DTX上[7-9]。

2.2化学分析法

薄层色谱法(TLC)是将固定相均匀地涂布成一薄层，以合适的溶剂作为流动相在点样后进行洗脱，对混合毒素进行分离、鉴定、定量的层析分离技术。研究者曾用于DSP、OA、DTXs的检验，对OA毒素的检出限较高，约为1 μg[8]。对大多数贝类毒素分析检测而言，薄层色谱法因检出限过高、定量不精确等缺点，并未得到广泛应用。

液相色谱法(HPLC)是利用两相对混合物中不同组分亲和力的差别来达到分离效果的一种定性和定量分析技术。目前主要是高效液相色谱法，研究者曾用于DSP、OA、DTX，对OA的灵敏度很高，检测浓度达到0.1 μg /100 g[8]。但由于样品基质存在很大背景干扰、检测分析成本高、仪器设备昂贵、操作维护要求高等问题，液相色谱法在贝毒检测方面的应用受到一定限制。

液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)将色谱的分离和质谱的定性结合，是一种能精准定量，并能提供准确分子结构信息的新型检测技术。该方法具有高灵敏度和特异性，虽然起步较晚，但发展迅速，是目前在海洋生物毒素分析检测中最有优势的一种方法。国内很多学者都使用液质联用法对DSP进行检测分析，取得了很好的结果[9]。在所有六大类脂溶性贝毒，如OA、AZA、BTX、PTX、CI中均建立了相应的液质联用法，因该方法具备极强的定性和未知物筛查能力，对新型毒素的发现及确证也具有很大的意义。

3 发达国家对贝类毒素的监控限量

欧盟、加拿大、FAO和WHO等对贝类均有严格的卫生标准和要求，其中包括感官指标、微生物指标，也包括贝类毒素的限量和风险评估[10]。对于OA、AZA、PTX，鲜活全贝的限量标准均为160 μg/kg；PSP和ASP在欧盟的限量标准是80 μg/100 g、20 mg/kg， 对PSP，美国、日本、韩国、澳大利亚、中国也是采取这一标准，菲律宾和挪威则是40 μg/100g ；YTX为1 000 μg/kg；CI类尚无限制类规定，仅有欧盟提出限制浓度建议[11-12]。由于这些标准尚缺乏充分的毒理学依据支持，欧盟食品安全局会定期对贝毒的限量标准进行重新评估[13]。

表2 目前主要贝类毒素的限量标准规定Tab.2 Standard limits for major shellfish biotoxins

欧盟和贝类养殖业发达国家除了重视贝类毒素的分析检测方法和限量标准外，更强调对贝毒潜在爆发风险的评估等相关基础研究，包括产生毒素的藻类、毒素种类、受影响的贝类和对人类健康危害的作用机制等[13]。

4 小结

中国是一个赤潮高发国家，几乎所有沿海海域都曾爆发过赤潮。OA、DTX、AZA、YTX等贝毒也在我国海域陆续被发现，这不仅对食品安全造成威胁，也给海洋生态系统带来危害。而我国在贝类毒素研究方面依旧存在一定的不足和缺陷，也缺乏迅速有效的应对机制和措施，目前也尚未开展系统的风险评估工作。同时，尽管我国贝类养殖产量巨大，但出口非常有限，因贝类卫生控制不达标，一度受到欧盟等发达国家的出口禁令。这些不仅导致我国应对贸易壁垒能力不足，也不利于贝类养殖产业的可持续发展。因此，应系统开展我国养殖海域环境及生物中贝类毒素的调查和来源分析、贝毒的毒理学研究，完善风险评估和监控预警技术，加快建立健全涉及贝类养殖、加工、运输等各个环节的贝毒控制相关法律、法规。

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Researchadvancesinshellfishbiotoxins

RUAN Wen, JI Wei-wei, YUE Dong-dong, FANG Hai, LIU Qin, WANG Lu-jun, WANG Yun, ZHANG Xiao-feng, LU Ya-nan*

(KeyLaboratoryofOceanicandPolarFisheries,MinistryofAgriculture,EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China)

Shellfish is a very popular aquatic product in Chinese market, but the biotoxins in shellfish have caused many food safety accidents, severely threatening consumers’ health and hindering the sustainable development of mariculture. The paper introduced the typical types of shellfish biotoxins such as ASP, PSP, DSP, NSP，AZA and CI biotoxins, then reviewed the origins of shellfish biotoxins and their distribution areas, further presented the two basic methods for analysis and determination of shellfish biotoxins, finally gave a description of the monitoring limit standards for shellfish biotoxins in some developed countries and regions, hoping to provide some references for the monitoring and regulation of shellfish biotoxins in China.

shellfish biotoxins; origin; distribution; determination methods; limit standard

2095-3666(2017)04-0276-05

10.13233/j.cnki.fishis.2017.04.006

2017-09-20

2017-11-7

上海市科学技术委员会2015年度仪器试剂项目(15142201600)

阮 雯(1985-)，女，助理研究员。主要从事海洋渔业类期刊编辑和资料收集工作。

E-mail:344519968@qq.com

陆亚男(1976-)，女，副研究员。E-mail:luyn@ecsf.ac.cn

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