瓦楞子及其混伪品成分的比较分析研究

陶明宝，鄢玉芬，陈林，刘友平，陈鸿平

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瓦楞子及其混伪品成分的比较分析研究

陶明宝，鄢玉芬，陈林，刘友平，陈鸿平

目的：探讨瓦楞子及其混伪品在成分上的差异性，为市售瓦楞子的合理安全用药提供依据。方法：本实验拟对所有样品的碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及水解后样品中的总氨基酸含量进行测定。结果：所有样品的碳酸钙含量为90.55 %～99.22 %、水煎液Ca2+含量为0.101 %～0.157 %、水溶性浸出物含量为0.16%～0.59 %、水浸液pH值为9.25～9.52、总氨基酸含量为0.020 %～0.099 %。结论：瓦楞子及其混伪品碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及总氨基酸含量无明显差异。

瓦楞子；混伪品；碳酸钙；总氨基酸

瓦楞子为蚶科动物毛蚶Arca subcrenataLischke、泥蚶Arca granosaLinnaeus或魁蚶Arca in fl ataReeve的贝壳。别名蚶子壳、毛蛤、瓦垅等[1]，具有消痰化瘀，软坚散结，制酸止痛的功效，主治顽痰胶结、黏稠难咯、瘿瘤、瘰疬、癥瘕痞块、胃痛泛酸。药材药效明确，应用广泛，但其混伪品较多，质量控制尚不完善。瓦楞子及其混伪品主要由无机成分和有机成分组成，其中以无机成分为主，主要由碳酸钙组成，有机成分以含量不等的蛋白质为主。文献报道，瓦楞子以碳酸钙为主[2-4]，含有14～16种氨基酸[5-6]。

目前，蚶科同属不同种及不同属的品种较多，由于伪品与瓦楞子极为相似，不易区别，各地经销使用常有混伪现象，从而造成了瓦楞子入药品种的混乱。本实验共收集到舟蚶、密肋粗饰蚶、结蚶、异毛蚶、球蚶五种伪品，均混合在瓦楞子中销售使用，瓦楞子用药的安全性、有效性及合理性难以保障。因此，本研究以瓦楞子及其混伪品的主要成分为研究目标，从碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及总氨基酸含量五个方面进行系统的比较研究。通过比较分析研究，以期为瓦楞子临床用药的安全性、合理性提供基础，同时为瓦楞子扩大药源提供一定的依据。

1 材料

UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)；QT-1旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；85-2控温磁力搅拌器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；十万分之一BP211D电子天平，万分之一BP121S9电子天平（德国Sartouris股份有限公司）；SB25-12D 超声清洗机（上海冠特超声仪器有限公司）；UPT-I-10T 优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

甘氨酸对照品(140689-200401)购自中国药品生物制品检定所；基准氧化锌(2016042101)、茚三酮、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、苯酚、氢氧化钾、氯化铵、乙二胺四乙酸二钠、钙黄绿素、甲基红、氯化钠、氯化钾、氨水(氢氧化铵)、铬黑T均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂。

所有药材均为市售品及产地收集，共收集56批，经成都中医药大学药学院卢先明教授鉴定，其中分离鉴定出毛蚶8批、泥蚶18批、魁蚶8批、舟蚶3批、密肋粗饰蚶4批、结蚶4批、异毛蚶8批、球蚶3批，样品收集信息见表1。

表1 样品信息

in fl ata Reeve）东山KH-17魁蚶（Arca in fl ata Reeve）福建省厦门市福建厦门2016/11/18

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所收集的样品中，瓦楞子伪品混在其中，少则一种多达五种以上，其混伪品主要有密肋粗饰蚶、结蚶、舟蚶、球蚶、异毛蚶，混伪品在样品中比重较大，外观性状与瓦楞子极为相似；所收集的样品中，魁蚶中多混有密肋粗饰蚶，毛蚶中多混有异毛蚶，泥蚶中多混有结蚶；目前市面上主要流通的伪品为异毛蚶和球蚶，其次是密肋粗饰蚶，流通较少的是结蚶和舟蚶。瓦楞子的三个基源具有明显的地域特征，泥蚶主要产自福建，魁蚶主要产自山东、广东，毛蚶主要产自广西。

2 方法与结果

2.1 总钙含量测定

2.1.1 EDTA-2Na滴定液标定 取于约800 ℃灼烧至恒重的基准物氧化锌0.12 g，精密称定5份，加稀盐酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0.025 %甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 mL与氨-氯化铵缓冲液（pH=10.0）10 mL，再加铬黑T指示剂少量，用本液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL EDTA-2Na（0.05 moL⋅L-1）相当于4.069 mg的氧化锌。结果表明，EDTA-2Na溶液平均消耗量为29.41 mL，经计算本滴定液浓度为0.0503 moL⋅L-1，每1 mL此滴定液相当于5.030 mg的碳酸钙。

计算公式：C=0.05*m/[0.004069*(V1-V2)]

（C为EDTA-2Na滴定液浓度moL⋅L-1；m为基准氧化锌的质量g；V1为EDTA-2Na滴定液用量mL；V2为空白试验EDTA-2Na滴定液用量mL）

2.1.2 含量测定 参照《中国药典》2015年版[7]，蛤壳项下碳酸钙含量测定方法，取本品细粉约0.12 g，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸3 mL，加热至微沸使溶解，加水100 mL与甲基红指示液1滴，滴加氢氧化钾试液至显黄色，继续多加10 mL，再加钙黄绿素指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 moL⋅L-1)滴定至溶液黄绿色荧光消失而显橙色。按上述方法对收集的样品进行碳酸钙含量测定，计算公式：总钙含量（%）=（耗EDTA-2Na量（mL）*5.030）*10-3/药材质量（g）*100 %，结果见表3。

2.2 水煎液Ca2+含量测定

将供试品粉碎过60目筛，取粉末2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加水50 mL，回流煮沸0.5 h，冷却后用水补足失重，摇匀，滤过，滤液备用。精密吸取滤液10 mL于250 mL锥形瓶中，加稀盐酸1 mL，加水50 mL，加甲基红指示剂1滴，滴加氢氧化钾试液呈黄色，再加氢氧化钾试液10 mL，加钙黄绿素指示剂少许，用乙二胺四醋酸滴定液滴定至溶液黄绿色荧光消失而显橙色[8-9]。按上述方法对收集的样品进行水煎液Ca2+含量测定，计算公式：水煎液Ca2+含量（%）=水煎液Ca2+的量（g）/药材质量（g）*100 %，结果见表3。

2.3 水溶性浸出物含量测定

按《中国药典》2015年版四部通则浸出物测定法测定[10]，取供试品约2～4 g，精密称定，置100～250 mL的锥形瓶中，精密加水50～100 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 °C干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。按上述方法对收集的样品进行水溶性浸出物的测定，计算公式：水溶性浸出物含量（%）=水溶性浸出物重量（g）/药材质量（g）*100 %，结果见表3。

2.4 水浸液pH值测定

将供试品粉碎过80目筛，取粉末0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入20 mL煮沸的蒸馏水，振摇10 min，放置30 min，滤过，滤液用精密pH计测其pH值[11]。按上述方法对收集的样品进行水浸液pH值的测定，结果见表3。

2.5 总氨基酸测定

2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取甘氨酸对照品5 mg于100 mL量瓶中，加蒸馏水适量溶解，定容至刻度，摇匀，即得(每1 mL含甘氨酸0.05 mg)。

2.5.2 供试品溶液的制备 取样品粉末0.5 g，精密称定，加人2 mL乙醇，混匀，置磁力搅拌器上搅拌，缓慢加入稀盐酸溶液5 mL，搅拌至反应完全，离心，弃去上清，挥干乙醇即得壳角蛋白。将得到的壳角蛋白转移至10 mL安瓿瓶中，加人5 mL 6 moL⋅L-1盐酸溶液，加人2～3滴苯酚，充N2封口，置110 ℃烘箱中水解24 h后取出，放冷，转移至10 mL量瓶中，加入6 moL⋅L-1氢氧化钠溶液5 mL定容至刻度，用0.45 µm微孔滤膜滤过后即得。取一定量水解样品，加入1 mL pH6.8的磷酸盐缓冲溶液混匀，加入1.5 mL 2 %茚三酮溶液，于100 ℃沸水浴中反应20 min后，取出放冷，转移至10 mL量瓶，以蒸馏水洗涤试管3次后，定容至刻度，混匀，于568 nm处测定吸光度。

2.5.3 总氨基酸含量测定

标准曲线

精密移取不同浓度的甘氨酸对照品溶液1 mL于具塞试管中，按显色方法显色，于568 nm进行测定。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程Y=229.15X-0.003，相关系数r为0.9994，甘氨酸在0.0101～0.0455 mg线性关系良好。

准确度

精密移取瓦楞子样品溶液0.5 mL于具塞试管中，平行制备6份，分别加入甘氨酸对照品溶液（0.056 mg⋅mL-1）0.5 mL，按显色方法显色，于568 nm处测定吸光度值，按公式计算回收率。结果显示，6份样品的回收率均在95 %～105 %，平均回收率为101.8 %，RSD为3.1 %，表明该方法准确度良好，见表2。

表2 总氨基酸加样回收率

重复性试验

按照供试品制备方法，平行制备六份供试品溶液进行测定，计算结果的RSD，结果显示RSD为3.5%，表明重复性良好。

精密度试验

按供试品制备方法，平行制备6份供试品溶液进行测定，结果显示RSD为0.09 %，表明该方法精密度良好。

稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60 min时测定吸光度，结果显示RSD为0.35 %，供试品在1 h内基本稳定。

2.5.4 样品测定 按实验方法，对所有样品水解液中的总氨基酸进行测定，计算公式：总氨基酸含量（%）=总氨基酸的量（g）/药材质量（g）*100%，结果见表3。

表3 所有样品成分含量比较

JH-0196.670.101 0.369.36 0.039 JH-0697.780.106 0.389.38 0.043 JH-1895.630.104 0.259.37 0.057 JH-2197.750.101 0.169.38 0.063 YH-1896.310.123 0.229.40 0.041 YH-1995.230.136 0.289.41 0.074结蚶（Arcanodifera）

结果表明，所有样品碳酸钙含量为90.55%～99.22 %，水煎液Ca2+含量为0.101 %～0.157 %，水溶性浸出物含量为0.16 %～0.59 %，水浸液pH值为9.25～9.52，总氨基酸含量为0.020 %～0.099 %。所有样品碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值之间的微小差异可能与不同的种，不同的产地以及购买时药材的清洁程度有关。所有样品氨基酸含量的差异可能与不同的种、不同的产地、药材残肉的多少、药材的清洁程度有关。药材残肉多，氨基酸含量则偏高，药材残肉少、清洁度低，氨基酸含量则偏低。因此，从总体上比较分析，瓦楞子及其混伪品的碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及总氨基酸含量无明显差异。

3 讨论

样品收集过程中，发现瓦楞子伪品较多，且在样品中比重较大，伪品主要有密肋粗饰蚶、结蚶、舟蚶、球蚶、异毛蚶；市面上主要流通的伪品为异毛蚶和球蚶，其次是密肋粗饰蚶，流通较少的是结蚶和舟蚶。瓦楞子的三个基源具有明显的地域特征，泥蚶主要产自福建，魁蚶主要产自山东、广东，毛蚶主要产自广西，且有毛蚶的样品中基本都混杂着异毛蚶。

本研究从5方面对瓦楞子及其混伪品共8个种进行了系统的比较分析研究，通过对碳酸钙含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值的测定，结果表明瓦楞子正品（毛蚶、泥蚶、魁蚶）与伪品（结蚶、球蚶、异毛蚶、舟蚶、密肋粗饰蚶）之间无明显差异；通过采用茚三酮显色法对瓦楞子及其混伪品中总氨基酸的含量进行测定，分析结果显示，瓦楞子正品与伪品间也无明显差异。

本实验主要对瓦楞子及其混伪品的碳酸钙和氨基酸进行了比较分析研究，研究发现瓦楞子及其混伪品间在成分上无明显差异，这为瓦楞子临床用药的安全性、合理性提供了一定的依据，同时本实验也将继续借助差热分析、X-射线衍射和X-荧光分析等手段，进一步对瓦楞子及其混伪品的碳酸钙晶型、元素种类等进行比较分析研究，以确保市售瓦楞子的安全性、合理性及有效性，同时为资源的充分利用及其临床应用提供可靠依据。

[1] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编 上[M ].北京∶人民卫生出版社,1975∶181.

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Comparative analysis of composition of Walengzi and its counterfeit

/TAO Ming-bao, YAN Yu-fen, CHEN Lin, LIU You-ping, CHEN Hong-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To discuss the differences in the composition of Walengzi and its counterfeit, and provide the basis for the rational use of the commercially available Walengzi.Method:The content of calcium carbonate in all samples, the content of Ca2+in water, the content of water soluble extract, the pH value of aqueous solution and the total amino acid content in the sample after hydrolysis were detected.Result:The content of calcium carbonate was 90.55 %～99.22 %. The content of Ca2+in the decoction was 0.101 %～0.157 %. The content of water soluble extract was 0.16 %～0.59 %. The pH value of the aqueous solution was 9.25～9.52. The total amino acid content was 0.020 %～0.099 %.Conclusion:No significant differences in the content of calcium carbonate, the content of Ca2+, the content of water soluble extract, the pH value and total amino acid content of water extract are found among Walengzi and its counterfeit.

Walengzi; counterfeit goods; calcium carbonate; total amino acid

R 282.6

A

1674-926X(2017)06-002-05

《全国中药饮片炮制规范》研究项目(2015-YP-48)

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

陶明宝（1992-），女，在读硕士，从事中药化学成分与质量标准化研究Tel∶18728431648 Email∶2587578725@qq.com

陈鸿平（1980-），女，博士，从事中药炮制、中药质量标准化及药效物质基础研究Tel∶13982283303 Email∶chenhongping@126.com

2017-07-20

（责任编辑：胡慧玲）