虎掌南星多糖含量及单糖组成研究

莫雪林，刘玉杰，李涛，黎江华，吴纯洁

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虎掌南星多糖含量及单糖组成研究

莫雪林，刘玉杰，李涛，黎江华，吴纯洁

目的：研究虎掌南星多糖的含量及其单糖种类及摩尔比。方法：首先采用水提醇沉的方法提取虎掌南星多糖并用苯酚-硫酸法来测定其粗多糖含量；再用柱前衍生化-高效液相色谱法来测定单糖组成并通过标准回归方程计算单糖摩尔比。结果：虎掌南星多糖提取率为4.65%，含有量为56.3%，由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，其单糖摩尔比为3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69。结论：苯酚-硫酸法具有显色稳定，操作简便，重复性良好等优点，可用于虎掌南星多糖含有量的测定；柱前衍生化高效液相色谱法具有简单、准确、快速、重现性好等优点，可用于虎掌南星多糖中单糖组成分析。

虎掌南星；多糖；单糖组成；苯酚-硫酸比色法；高效液相色谱法

虎掌南星为天南星科植物掌叶半夏(Pinellia pedatisectaSchott.)的干燥块茎，具有化痰散结的功效[1]。虎掌南星的化学成分组成较多，主要含有生物碱类、环二肽类、甙类、β-谷甾醇，氨基酸类、多糖、凝集素A和大量无机微量元素等[2]。大量研究表明，虎掌南星具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、镇静镇痛、抗惊厥等[3]。查阅文献可知，目前研究较多的活性成分包括生物碱类[4]、核苷类[5]、总有机酸[6]、凝集素A[7,8]和氨基酸[9]，缺乏对虎掌南星多糖研究。近年来，随着各种提取、分离、纯化方法的进步和发展，同时伴随着核磁共振及质谱等技术的日益成熟，使多糖的研究逐渐深入和扩大，不断的有新的多糖被发现[10]，多糖的相关研究成为热门，目前已有大量实验证明中药多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗应激、抗辐射及抗衰老等多种生物活性，且作为药物其毒副作用极小[11]。

目前在多糖的研究中，单糖组成的分析对多糖性质、结构及其构-效关系研究具有非常重要的意义，同时将有助于更加全面的掌握其结构及其药理作用。但由于多糖的光学特性较差，在紫外下吸收较弱，若采用高效液相色谱法测定单糖组成时需应用荧光试剂对样品进行衍生化处理后方可检测到相关化学信号。因此，本实验运用柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）法测定虎掌南星多糖的单糖种类组成及摩尔比，对虎掌南星多糖的基本性质进行初探，以期为进一步寻找虎掌南星多糖中的活性成分及其构-效关系奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；BP 211D万分之一天平（SARTORIUS公司）；UPT-11-10T 优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）；QL-901涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 材料

甘露糖（批号∶151112）、葡萄糖（批号∶150929）、半乳糖（批号∶151110）和阿拉伯糖（批号∶150918）均购于四川省维克奇生物科技有限公司，半乳糖醛酸（批号：111646）购于中国药品生物制品检定所；1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）（AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）；三氟乙酸、磷酸二氢钾、氯仿、氢氧化钠（AR，均购自成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂为分析纯。虎掌南星样品购于四川省成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学李敏教授鉴定为天南星科植物掌叶半夏（Pinellia pedatisectaSchott.）的干燥块茎。

2 方法与结果

2.1 虎掌南星多糖提取

将干燥的虎掌南星样品磨碎，过60目筛，称取150 g的虎掌南星样品置于圆底烧杯中，并用3倍量95%的乙醇回流2 h去除有色物质，单糖，低聚糖和小分子物质。过滤，药渣挥尽乙醇后，加入10倍量的蒸馏水，加热回流提取2次，每次2 h，提取液冷却至室温后，过滤，合并两次滤液，通过真空旋转蒸发仪将滤液浓缩至300 mL，加入一定量淀粉酶除去淀粉后，加热除去多余淀粉酶，冷却后，离心（5000 r⋅min-1，10 min），过滤，上清液缓慢加95%乙醇使醇含量达到80%，充分搅拌，于4 ℃冰箱中静置过夜，抽滤，滤渣依次用3 ～ 5倍体积的无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤3次，然后50 ℃减压干燥，即得虎掌南星多糖，计算其多糖提取率为4.65%。

2.2 虎掌南星多糖含量测定

[12]以葡萄糖作为标准物质，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量。

2.2.1 样品溶液的制备 精密称取“2.1”项下提取的虎掌南星多糖10 mg，定容到100 mL的容量瓶中，即得质量浓度为0.1 mg⋅mL-1的样品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg，定容到100 mL的容量瓶中，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg⋅mL-1的葡萄糖标准溶液。

2.2.3 线性关系考察 精密移取对照品溶液0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，分别加水至2.0 mL，迅速加入5.0%苯酚溶液1 mL，摇匀，再加入5 mL的浓硫酸，摇匀，室温反应10 min，然后置于沸水中水浴加热15 min，取出置于冷水中冷却至室温，于490 nm处测定对照品溶液的吸光度A。以A为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，得回归方程Y = 4.6629X - 0.0539（R= 0.9999），表明葡萄糖质量浓度在0.0025～0.015mg⋅mL-1内呈现良好线性关系。

2.2.4 多糖含量测定 精密吸取对照品及样品溶液各1 mL，加水至2.0 mL，并迅速加入5.0%苯酚溶液1 mL，摇匀，再连续加入5 mL的浓硫酸，摇匀，室温下反应10 min，然后置于沸水中水浴加热15 min，取出置于冷水中冷却至室温，以水作为空白对照组，于490 nm处测定样品溶液及空白对照组溶液的吸光度A。由“2.2.3”中的回归方程计算样品溶液中葡萄糖浓度，并计算虎掌南星多糖中多糖含量为56.3%。

2.3 虎掌南星多糖的单糖组成

单糖组成分析参考文献[13]，采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法进行。

2.3.1 虎掌南星多糖的水解液的制备 精密称取虎掌南星多糖样品20 mg，放入10 mL的具塞试管中，加入2 moL⋅L-1三氟乙酸（TFA）溶液8 mL，涡旋，使其完全溶解，然后放置于110 ℃烘箱内5 h使虎掌南星多糖充分水解，冷却至室温，离心（5000 r⋅min-1，10 min）得到的上清液，用旋转蒸发仪将上清液旋干，并用甲醇溶液反复旋蒸3次除去残留的TFA溶液，加入2 mL的超纯水溶解定容，即得到虎掌南星多糖水解液。

2.3.2 单糖对照品溶液的制备 分别精密称取一定量的甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5种单糖对照品于2mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，得到一定质量浓度的单糖对照品溶液。取等体积的5种单糖对照品溶液混合，即得混合单糖对照品溶液。

2.3.3 单糖对照品和样品溶液的衍生化溶液的制备 分别精密量取混合单糖对照品溶液和虎掌南星多糖水解溶液各0.2 mL于2 mL的EP管中，依次加入0.2 mL 0.5 moL⋅L-1的PMP甲醇溶液和0.2 mL 0.3 moL⋅L-1NaOH溶液，混匀后于70℃水浴加热1 h，并不时振摇，取出室温冷却10 min，用0.2 mL 0.3 moL⋅L-1HCl中和，混匀后用1 mL三氯甲烷萃取，涡旋3 min，离心（5000 r⋅min-1，10 min），小心弃去有机层（下层），连续萃取3次，上层水相，加水定容至5 mL，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，得到溶液，用于HPLC分析。

2.3.4 色谱条件 色谱柱：PHENOMENEX C18（250×4.6 mm，5 μm），流动相：0.05 M磷酸缓冲液（pH=6.8）和乙腈的混合物（82∶18，v/v），柱温：30 ℃，流速：1.0 mL⋅min-1，检测波长：245 nm，进样体积：10 μL。

2.3.5 线性关系考察 取混合单糖对照品衍生化溶液，按照“2.3.4”项色谱条件下分别进样2、4、6、8、10 μL，测定峰面积。以单糖的进样量（ug）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，其回归方程见表1。

表1 单糖的标准曲线方程

2.3.6 精密度试验 取虎掌南星衍生化样品溶液，按照“2.3.4”项色谱条件下连续进样6次，记录各吸收峰面积，分别以峰面积计算其RSD值，结果甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为2.93%，2.41%，0.22%，1.77%，2.77%，表明方法精密度良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取6份虎掌南星多糖样品，每份约20 mg，经水解及衍生化处理后按照“2.3.4”项色谱条件下进样6次，测定峰面积，通过计算得到甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为1.18%，1.81%，0.080%，1.25%，2.21%。

2.3.8 稳定性试验 取虎掌南星多糖衍生化溶液，分别在0、2、4、8、12、16 h，按照“2.3.4”项色谱条件下进样，记录峰面积，通过计算得到甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD值分别为2.57%，2.27%，0.17%，1.73%，1.94%，结果表明虎掌南星样品溶液在16 h内稳定。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取6份虎掌南星多糖样品，每份约20 mg，分别加入混合单糖对照品溶液适量，经水解衍生化处理后，按照“2.3.4”项色谱条件下进样，记录峰面积，计算加样回收率，甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率和RSD值。结果表明：甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为：99.8%，99.2%，98.9%，100.1%，99.6%，RSD值分别为1.57%，1.69%，2.31%，1.03%，1.89%。

2.3.10 样品分析 将单糖混合对照品的图谱与虎掌南星多糖的色谱图谱进行对比（见图 1），并根据单糖峰面积计算虎掌南星多糖中各个单糖的含量及其摩尔比。由图可知，虎掌南星多糖由4种中性单糖（甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖）和1种酸性单糖（半乳糖醛酸）组成。通过对样品峰面积的计算可知，虎掌南星多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69，其中葡萄糖含量最大，推测其原因可能是由于提取的虎掌南星多糖不够纯，含有一定量的淀粉，其在淀粉酶酶解的条件下转化为二糖—麦芽糖，麦芽糖在酸性条件下彻底水解成为单糖葡萄糖。

图1 混合单糖对照品(a)和虎掌南星多糖水解后样品(b)的HPLC图

3 结论

本实验采用传统的水提醇沉法，对虎掌南星多糖进行提取，以苯酚-硫酸比色法测定其多糖含有量。目前，苯酚-硫酸法作为一种常用经典的方法，具有灵敏度高，重现性好等优点，被广泛运用于多糖含量的测定，包括单糖、寡糖以及均一多糖的含量测定[14]。因此，可作为虎掌南星多糖含量测定的方法。由于多糖类化合物不具备发色基团，缺乏特征的紫外吸收，不能直接用紫外进行检测。因此，本实验采用PMP柱前衍生化操作使虎掌南星多糖样品水解后的单糖带上发色基团，增强紫外检测信号，从而提高了其检测灵敏度。该单糖测定方法具有准确可靠，灵敏度较高，取样量少等优点，并可有效分离各单糖，可以实现在普通实验室中运用常见的紫外检测器和C18柱来分离分析虎掌南星多糖的单糖组成，这种测定方法也可运用于其他多糖的单糖组成测定[15]。本研究主要对虎掌南星的基本性质（多糖含量和单糖组成）进行了研究，以期为进一步寻找虎掌南星多糖中的活性成分及其构-效关系奠定基础。

参考文献

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Studies on the polysaccharide content and monosaccharide composition of Pinellia pedatisecta

/MO Xue-lin, LIU Yu-jie,LI Tao, LI Jiang-hua, WU Chun-jie//(School of pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137,Sichuan)

Objective:To study the polysaccharides content of Pinellia pedatisecta, and the monosaccharide composition and mole ratio.Method:Water extraction and alcohol precipitation method was used to extract polysaccharides from Pinellia pedatisecta,and the content of polysaccharides was detected by phenol sulfuric acid method. Then Pre column Derivatization - High performance liquid chromatography was used to investigate the monosaccharide composition and the linear regression equation was conducted to calculate the molar ratio.Result:The extraction rate of Pinellia pedatisecta polysaccharides was 4.65%, and the content of polysaccharides was 56.3%. The monosaccharides of the polysaccharides were composed of mannose, galacturonic acid, glucose,galactose and arabia sugar, and the monosaccharide ratio were 3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69.Conclusion:Phenol sulfuric acid method is stabile, simple and repeatable, and it can be used for the determination of polysaccharides content of Pinellia pedatisecta. Pre column Derivatization High Performance Liquid Chromatography is simple, accurate, rapid and reproducible, and it can be used for the analysis of the monosaccharide composition of Pinellia pedatisecta polysaccharides.

Pinellia pedatisecta; polysaccharides; monosaccharide composition; phenol-sulfuric acid method; High performance liquid chromatography

R282.6

A

1674-926X(2017)06-004-04

成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

莫雪林，女，硕士研究生在读，从事中药炮制与制剂方向。Tel∶13730876479 Email∶moxuelinde@126.com

吴纯洁，男，研究员，从事中药炮制与制剂方向。Tel∶028-61801001 Email∶wcj-one@163.com

2017-03-21

（责任编辑：李芸霞）