葛根素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖凋亡的影响

刘银莉,王 营

葛根素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖凋亡的影响

刘银莉1,王 营2*

目的探讨葛根素对人胰腺癌细胞株PANC-1的作用及其机制。方法取对数生长期的PANC-1细胞，分别用不同浓度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)干预48 h后，利用CCK-8检测PANC-1细胞增殖水平；Annexinv-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测Fas、Fas-L、Bax、Bcl-2、Caspase-7表达水平。结果葛根素对胰腺癌PANC-1细胞增殖的抑制呈浓度依赖性；不同浓度的葛根素干预PANC-1细胞48 h后，细胞凋亡率分别为2.47%±0.64%、6.37%±0.71%、8.33%±0.90%、12.40%±1.01%，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)；Western blot实验表明，葛根素对胰腺癌PANC-1细胞干预48 h后，随着葛根素浓度的增加，细胞中Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax蛋白的表达量上调，Bcl-2的表达量下调，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论葛根素可通过激活Fas/Fas-L信号通路诱导PANC-1细胞增殖抑制和凋亡。

葛根素；PANC-1细胞；增殖；凋亡；Fas/Fas-L

0 引言

胰腺癌是临床上常见的恶性肿瘤，据统计，胰腺癌的死亡率与发病率的比例为0.99∶1。在我国，近十年来胰腺癌的发病率居恶性肿瘤的第6～7位[1]。胰腺癌患者的中位生存时间为3～5个月，1年生存率<10%[2]。该病早期不易发现、无化学预防手段、早期易复发和转移，80%以上的胰腺癌就诊时已无法手术切除。葛根素是从豆科葛属植物野葛、甘葛藤根中提取的一种异黄酮苷成分,临床上主要用于心脑血管疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死；缺血性脑血管病，如脑血管痉挛；眼底病，如视网膜动静脉阻塞、视神经萎缩等。近年来发现其在肿瘤方面发挥一定的作用[3-5]。本文以胰腺癌为靶细胞，初步探讨葛根素对人胰腺癌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人胰腺癌细胞株PANC-1(徐州医科大学消化科实验室冻存)；葛根素(上海源叶生物科技有限公司，批号：B20446，纯度>99%)；DMEM培养基(HyClone公司)；青霉素、链霉素(美国Gibco公司)；DMSO(上海碧云天生物技术研究所)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；6孔培养板(美国Thermo公司)；96孔培养板(美国Thermo公司)；CCK-8试剂盒(微科曼得生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/P双染细胞凋亡试剂盒(江苏凯基生物公司，货号：KGA107)；细胞周期检测试剂盒(江苏凯基生物公司，货号：KGA512)；GAPDH抗体(美国CST公司)；Fas抗体(美国Affinity公司)；Fas-L抗体(美国Affinity公司)；Bcl-2抗体(英国Abcam公司)；Bax抗体(英国Abcam公司)；Caspase-7(美国CST公司)；RIPA蛋白裂解液(强)、蛋白酶抑制剂cocktail、Western blot凝胶制备试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)。

1.2 仪器 恒温CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；SEAC全自动酶标仪(北京西亚克技术有限公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinso公司)；Western blot电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将冻存的PANC-1细胞解冻后，置于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，加入青霉素(100 U·mL/L)和链霉素(100 U·mL/L)，在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。1～2 d更换培养基，观察细胞约80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3.2 CCK8法检测细胞增殖抑制率 调整细胞悬液浓度为4×104/mL，接种到96孔板，每孔200 μL，24 h后细胞贴壁，弃去培养基，每孔分别加入100 μL不同浓度(0、50、100、200 μmol/L)的葛根素溶液、0.5% DMSO溶剂，每组设5个复孔，并分别以PBS液为空白对照，置于培养箱中培养48 h后，弃上清，每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK-8溶液，继续放于培养箱中培养2 h后，使用酶标仪测定在450 nm处每孔的吸光光度值(OD)，并根据OD值计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=1-(实验组OD-空白孔OD)/(对照组OD-空白孔OD)。本实验步骤重复3次。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的细胞，以2×105/mL的PANC-1细胞密度接种到6孔板，24 h后加入不同浓度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)，常规条件(37 ℃、5% CO2饱和湿度)下培养，48 h后收集细胞并用PBS冲洗，根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，上机测定凋亡率。

1.3.4 Western blot检测Fas/Fas-L信号通路相关蛋白的表达 实验分为4个组：空白对照组，50、100、200 μmol/L葛根素给药组。各组细胞培养48 h后，提取细胞总蛋白，常规行10%SDS-PAGE电泳分离，转移至活化的PVDF膜上，封闭液封闭2 h，加一抗Fas(1∶1 000)、Fas-L(1∶1 000)、Caspase-7(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、GAPDH(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。TBST溶液洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记二抗(1∶8 000)，室温孵育l h，ECL法发光显色。GAPDH作为内参照。计算机扫描图像，检测各条带面积灰度值，以各组目的蛋白与自身GAPDH灰度值比值作为各组细胞中蛋白的相对含量。每组样本重复检测3次。

2 结果

2.1 葛根素对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示：溶剂对照组(0.5% DMSO)对胰腺癌PANC-1细胞的抑制作用与空白对照组相比，差异无统计学意义(P<0.05)，表明0.5% DMSO对胰腺癌PANC-1无增殖抑制作用。不同浓度的葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1细胞48 h后，细胞增殖抑制率分别为0、13.83%±0.03%、36.94%±0.03%、62.00%±0.08%。见图1。

图1 葛根素对胰腺癌PANC-1细胞增殖的抑制率注：与葛根素0 μmol/L比较，**P<0.01

2.2 葛根素对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响 流式双染法(Annexin V-FITCI和PI)检测结果见图2、表1。结果显示，经0、50、100、200 μmol/L葛根素处理PANC-1细胞48 h后，随着葛根素药物浓度的增加，PANC-1细胞的凋亡率逐渐增加，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明葛根素能够浓度依赖性地诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡。

图2 流式细胞仪检测葛根素对胰腺癌PANC-1细胞的凋亡率(48 h)

表1 葛根素对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响(48 h，n=3)

注：与葛根素0 μmol/L比较，**P<0.01

2.3 葛根素对PANC-1细胞Fas/Fas-L信号通路的影响 葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1细胞48 h后，Western blot检测结果显示，随着葛根素浓度的增加，胰腺癌PANC-1细胞中Fas、Fas-L、Caspase-7蛋白的表达水平升高，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。由此推断葛根素诱导PANC-1细胞凋亡可能是通过激活Fas/Fas-L信号通路，上调Fas、Fas-L、Caspase-7蛋白的表达实现的。见图3、表2。

图3 Western blot检测葛根素对胰腺癌PANC-1细胞Fas、 Fas-L、Caspase-7蛋白表达的影响(48 h)

2.4 葛根素对PANC-1细胞Bax和Bcl-2的影响 不同浓度葛根素(0、50、100、200 μmol/L)作用于胰腺癌PANC-1细胞48 h后，Western blot检测结果显示，随着葛根素浓度的增加，胰腺癌PANC-1细胞中Bax蛋白的表达水平增加，Bcl-2蛋白的表达水平下降，实验组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。可见葛根素可以通过调节Bax和Bcl-2蛋白的表达，影响线粒体膜电位的改变，进而诱导细胞凋亡。见图4、表2。

图4 Western blot检测葛根素对胰腺癌PANC-1细胞Bax、 Bcl-2蛋白表达的影响(48 h)

3 讨论

既往大量研究表明，葛根素对多种肿瘤具有抗肿瘤作用，但查阅大量国内外文献可知，葛根素对胰腺癌的抗肿瘤作用尚未见报道，因此，本实验旨在通过体外实验研究葛根素对胰腺癌是否具有抗肿瘤作用。CCK-8法检测结果显示，葛根素对胰腺癌PANC-1细胞具有增殖抑制作用，且具有浓度依赖性；流式细胞术检测结果表明，随着葛根素浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。

细胞凋亡在肿瘤的发生和发展中具有重要作用，目前研究表明，主要有两条途径涉及凋亡过程：细胞膜上的死亡受体途径和细胞内的线粒体途径[6]。其中，在死亡受体途径中最具代表性的是Fas/Fas-L介导的细胞凋亡，Fas是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由325个氨基酸组成，广泛存在于人体各种组织和细胞中。Fas-L是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达在细胞毒T淋巴细胞、免疫豁免区和各种肿瘤细胞表面。Fas-L作为Fas的配体，能与Fas结合启动细胞的程序性死亡[7]。研究发现，Fas表达上调可能导致细胞内Fas结构域自发齐聚，和独立的Fas-L结合后引起Fas过表达，从而诱导细胞凋亡[8]。同样，Fas和Fas-L也能够彼此独立地启动凋亡进程。Fas-L本身可以激活细胞内的信号转导途径，导致细胞周期阻滞，从而引起细胞凋亡。此外，Fas或Fas-L上调能增加和受体连接的几率，启动包括Caspase-7、Caspase-3在内的Caspases的级联反应。Caspases是一群结构类似的蛋白酶族，是细胞凋亡信号转导途径的关键效应分子，细胞凋亡程度与其表达水平的高低有关[9]。Caspases蛋白酶类包括凋亡的起始者和执行者，其能够在多个细胞系中被激活[10]。Caspase-7是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，与Caspase-3共同被认为是凋亡的最终执行者。

表2 不同浓度的葛根素作用于PANC-1细胞后Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax、Bcl-2蛋白表达量与内参比值的变化(48 h，n=3)

注：与葛根素0 μmol/L比较，*P<0.05，**P<0.01

研究表明，Fas-L可以表达在胰腺癌细胞中[11]。李伟良[12]研究发现，葛根素对人早幼粒白血病HL-60细胞Fas、Fas-L蛋白表达具有一定影响，葛根素处理后较处理前人早幼粒白血病HL-60细胞Fas、Fas-L蛋白表达水平明显升高，但无浓度依赖性。因此，我们推测，葛根素可能会对人胰腺癌PANC-1细胞Fas、Fas-L、Caspase-7表达产生影响。本实验采用免疫印迹法检测不同浓度的葛根素作用胰腺癌细胞48 h后Fas、Fas-L、Caspase-7的表达情况，发现随着葛根素浓度的增加，Fas、Fas-L、Caspase-7表达阳性率均明显升高，实验组和对照组相比差异有统计学意义。实验表明，葛根素可能通过上调Fas、Fas-L蛋白表达，激活下游效应因子Caspase-7，从而引起PANC-1细胞凋亡，但其对PANC-1细胞Fas/Fas-L信号通路上游分子的调节靶点与具体机制尚未完全明确，还需进一步研究。

Bcl-2蛋白家族属于线粒体凋亡途径的重要成员[13]，Bcl-2和Bax属于Bcl-2蛋白家族。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，可通过调控内质网Ca2+的释放来参与细胞核内外物质转运及膜通透性转换,保持线粒体内、从线粒体中释放,进而抑制细胞凋亡。Bax是一种促凋亡蛋白，与Bcl-2的作用相反，对促进肿瘤细胞的凋亡具有重要作用。研究表明，Bcl-2可与Bax结合，组成异源二聚体，减弱Bax促凋亡作用而抑制凋亡，Bax/Bcl-2比值的升高会引起细胞线粒体膜电位的改变，从而促使细胞凋亡[14-16]。本研究表明，葛根素作用胰腺癌PANC-1细胞48 h后，随着葛根素浓度的增加，Bax蛋白的表达量逐渐增加，Bcl-2蛋白的表达量逐渐下降，差异均有统计学意义。因此，Bax和Bcl-2组成的异源二聚体减少，Bax/Bax同源二聚体增加，Bax/Bcl-2比值升高，从而促进PANC-1细胞的凋亡。

综上所述，葛根素能抑制PANC-1细胞增殖，诱导PANC-1细胞凋亡，并可将细胞周期阻滞于G0/G1期，从而发挥抗胰腺癌的作用。其机制可能与葛根素激活Fas/Fas-L信号通路，上调Fas、Fas-L、Caspase-7、Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达有关，但胰腺癌的发生、发展是多因素影响过程，诱导凋亡的机制也是十分复杂的，仍需进一步研究。

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EffectsofpuerarinonproliferationandapoptosisofhumanpancreaticcancerPANC-1cells

LIU Yin-li1，WANG Ying2*

(1.Graduate School of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,China;2.Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of puerarin on human pancreatic cancer cell line PANC-1.MethodsPANC-1 cells of logarithmic growth phase were treated with different concentrations of puerarin (0,50,100 and 200 μmol/L) for 48 h;CCK-8 was used to detect the proliferation level of PANC-1 cells.Apoptosis was detected by Annexinv-FITC/PI double staining flow cytometry.Western blot was used to detect the expression of Fas,Fas-L,Bax,Bcl-2 and Caspase-7.ResultsPuerarin inhibited the proliferation of pancreatic cancer PANC-1 cells in a concentration-dependent manner.When different concentrations of puerarin interfered PANC-1 cells for 48 h,the apoptosis rate of cells respectively was 2.47%±0.64%,6.37%±0.71%,8.33%±0.90%,and 12.40%±1.01%,the difference between experimental group and control group being statistically significant (P<0.01).Western blot experiment showed that,after the 48 h intervention for PANC-1 of pancreatic cancer cell line,the expression of Fas,Fas-L,Caspase-7 and Bax protein increased with the increase of puerarin concentration,while the expression of Bcl-2 protein decreased,the difference between experimental group and control group being statistically significant (P<0.05).ConclusionPuerarin can induce PANC-1 cell proliferation inhibition；Apoptosis by activating Fas/Fas-L signaling pathway.

Puerarin;PANC-1 cell;Proliferation;Apoptosis;Fas/Fas-L

2017-04-02

1.徐州医科大学研究生学院，江苏 徐州 221002;2.徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221002

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711004