波形蛋白在原发性肝癌组织中的表达及临床意义

成 超，李海洋△，叶朝阳，李国炜

(贵州医科大学附属医院：1.肝胆外科；2.临床医学研究中心，贵阳 550004)

·经验交流·

波形蛋白在原发性肝癌组织中的表达及临床意义

成 超1，李海洋1△，叶朝阳2，李国炜1

(贵州医科大学附属医院：1.肝胆外科；2.临床医学研究中心，贵阳 550004)

目的探讨原发性肝癌(HCC)组织与癌旁组织中波形蛋白的表达及其临床意义。方法收集该院2015年1月至2016年3月30例手术切除的肝癌组织，离癌2～5 cm(简称癌旁近临)和离癌5 cm以外(简称癌旁近远)组织及患者临床资料。运用实时荧光定量PCR和免疫组织化学检测组织中波形蛋白表达，并用Image J软件及病理评分等对其表达量进行分析。结果癌组织、癌旁组织、正常肝组织标本里波形蛋白的mRNA分别为8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00，差异有统计学意义(Plt;0.05)。癌组织、癌旁近临和癌旁近远组织标本里波形蛋白表达量分别为75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差异有统计学意义(Plt;0.05)。波形蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤范围无关(Pgt;0.05)，与TNM分期、病理分级、淋巴结转移、远处转移有关(Plt;0.05)。结论检测HCC患者的波形蛋白表达有助于HCC诊断与预后。

原发性肝癌；波形蛋白；免疫组织化学；实时荧光定量PCR；基因表达

原发性肝癌(HCC)是发病率高、治疗困难、病死率高的恶性肿瘤之一，全球每年大约有250 000例患者死于HCC，因此受到全球临床医生和研究者的特别关注，如何早期诊断成为肝癌研究热点之一。正常分化上皮细胞不表达波形蛋白,而波形蛋白通常分布在中胚层来源的间质细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞等。大量研究表明，上皮源性肿瘤细胞异常表达波形蛋白,如乳腺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌等[1]，即表现出上皮细胞间充质转化(EMT)的病理特征，体现为上皮样功能减弱或消失而间质功能增强，并与上皮细胞纤维化及恶性肿瘤癌细胞的侵袭转移密切相关[2]。波形蛋白是一种在间质中表达的Ⅲ型中间丝蛋白，在细胞分裂的时候对染色体起支架的作用，并承担细胞中细胞器的分配和定位[3]。近年研究表明，波形蛋白参与肿瘤的发生和转移过程，在肿瘤细胞迁移、黏附及凋亡中均发挥重要作用，曾作为间叶组织起源肿瘤的特异性标记[4]。据了解，目前国内研究有关波形蛋白在肝癌细胞中的表达状况报道还较少。本项目用实时荧光定量PCR和免疫组织化学等技术检测波形蛋白在HCC组织、癌旁近临组织和癌旁近远组织标本中的表达状况，结合病理特征分析其临床肝癌诊断意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院肝胆外科2015年1月至2016年3月30例手术切除的肝癌组织，离癌2～5 cm(简称癌旁近临)和离癌5 cm以外(简称癌旁近远)的组织。其中男24例，女6例，平均年龄(52.2±7.1)岁。所有病例术前未行放疗、化疗，所有标本均经病理科检查证实。标本采集后冰块包被，在15 min内放置于-80 ℃冰箱保存。本次研究得到患者的知情同意并经本院医学伦理委员会批准[2014伦审第(83)号]。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测 实时荧光定量PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，引物序列及产物长度见表1。分别取肝癌、癌旁及正常肝组织各100 mg，研磨后转入1.5 mL微量离心管中。按照Trizol RMA试剂说明书进行操作。取2 μL RNA样品，紫外线分光光度仪Nanodrop2000上测定样品在260 nm和280 nm处吸光度(A)值，评估纯度，260/280均在1.65～2.00。

表1 引物序列

1.2.2反转录反应 反应体系20 μL，2 μL总RNA，2 μL Oligo-dt(10 μmol/L),2 μL 10×PCR buffer，2 μL Dntp(5 mmol/L)，M-MuLV反转录酶1 μL(4 U/μL)；加入适量的焦碳酸二乙酯使总体积为20 μL，37 ℃、60 min，70 ℃、15 min。最终生成对应的cDNA第一链。PCR体系20 μL含Maxima SYBR Green 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA模板2 μL，最后加无核酸酶的水将整个反应体系补充至20 μL。反应条件：50 ℃ 2 min 循环1次，95 ℃ 10 min 循环1次，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s循环40次。试剂购自上海捷瑞生物工程有限公司，实时荧光定量PCR反应由ABI Vii7来完成。

1.2.3结果判定 采用β-actin作为内参照，以β-actin内参的拷贝数为校正基数，实验各样本中波形蛋白的Ct值与同标本中β-actin内参的Ct值相减，为该标本的波形蛋白的ΔCt值；以正常肝组织中的波形蛋白与β-actin内参的差值ΔCt值作为校正，得出ΔΔCt值(肝癌组织ΔCt-正常肝脏组织ΔCt、癌旁组织ΔCt-正常肝脏组织ΔCt)，按目的基因表达量(RQ)=2-ΔΔCt,计算癌组织、癌旁组织中波形蛋白的相对表达水平。

1.2.4免疫组织化学检测 每个标本经4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置于20%(w/v)蔗糖溶液(4 ℃)中过夜。组织石蜡包埋后连续切片，取石蜡切片脱蜡、水化，滴加3%的H2O2-甲醇液30 min，以清除内源性过氧化物酶的影响，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加入0.3%Triton-100 30 min，以增加细胞的通透性，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；水洗，加一抗(抗波形蛋白,1∶100)，4 ℃存放24～48 h，吸去抗体，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加0.01 mol/L PBS稀释的二抗，室温孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次，蒸馏水迅速冲3次；加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间3～10 min，待细胞着色而背底颜色较淡时,马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲3次后加入0.01 mol/L PBS终止反应；苏木素复染，梯度脱水之后透明、封片、拍照。每组均设阴性对照，以Tris液替代一抗。SimPlePCI图像分析系统测定免疫组织化学测试区的阳性细胞数目、平均灰度级、阳性产物的平均灰度与面积、背景面积进行测量。

本院两位病理科医生按照随机双盲原则在光学显微镜下进行读片，每张切片随机选取5个(×40)高倍镜视野，并存取得到文件；按照Image J软件说明读取图片图像的灰度值。并结合HCC TNM分期评分标准(2015年)分组。(1)T-原发病灶：Tx为原发肿瘤不能测定；T0为无原发肿瘤的证据；T1为孤立肿瘤没有血管受侵；T2为孤立肿瘤，有血管受侵或多发肿瘤直径小于或等于5 cm；T3a为多发肿瘤直径大于5 cm；T3b为孤立肿瘤或多发肿瘤侵及门静脉或肝静脉主要分支；T4为肿瘤直接侵及周围组织，或致胆囊或脏器穿孔。(2)N-区域淋巴腺：Nx为区域内淋巴腺不能测定；N0为无淋巴腺转移；N1为区域淋巴腺转移。(3)M-远处转移：Mx为远处转移不能测定；M0为无远处转移；M1为有远处转移。(4)肝癌分期：Ⅰ期为T1N0M0；Ⅱ期为T2N0M0；ⅢA期为T3aN0M0；ⅢB期为T3bN0M0；ⅢC期为T4N0M0；ⅣA期为任何T，N1M0；ⅣB期为任何T，任何N，M1。

2 结 果

2.1实时荧光定量PCR检测 癌组织、癌旁组织及正常肝组织的波形蛋白的mRNA分别为8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00,差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表2。

表2 波形蛋白mRNA在各组织中的表达

2.2免疫组织化学检测 波形蛋白在癌组织中呈强阳性表达，在癌旁近临组织及癌旁近远组织呈弱阳性表达，而正常组织里无表达。癌组织、癌旁近临和癌旁近远组织样本里波形蛋白表达量分别为75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见图1。

A：癌组织；B：癌旁近临组织；C：癌旁近远组织;D:正常组织。

图1波形蛋白在各组织中病理切片表达(×400)

2.3临床病理资料 波形蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤范围无关(Pgt;0.05)，与TNM分期、病理分级、淋巴结转移、远处转移有关(Plt;0.05)。见表3。

表3 波形蛋白在HCC患者中的表达与临床病理关系

续表3 波形蛋白在HCC患者中的表达与临床病理关系

3 讨 论

恶性肿瘤是危害人类健康的主要原因，是目前导致疾病死亡的第二位因素。HCC是危害人类健康的肿瘤疾病,近10年来发病率逐年升高，由于恶性程度高、起病隐匿，早期诊断率和手术切除率均很低，且对放疗和化疗不敏感，预后差。

恶性肿瘤最具危害性之处在于它的侵袭转移性，HCC的侵袭转移是一个非常复杂的过程，为很多因素与环节相互作用的结果，其机制尚未清晰。尽管如此，目前人们也认识了许多重要的病理过程：恶性肿瘤发生侵袭转移时，癌细胞之间的黏附能力下降，细胞外基质框架结构被损坏，癌细胞向远处扩散转移及癌细胞扩散到其他部位形成新生血管等[5]。本研究也发现，在HCC细胞中波形蛋白异常表达，表现出EMT的病理特征，具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间充质细胞过程，这暗示EMT为HCC细胞脱离原发灶侵袭转移邻近组织提供必需的物质基础，由此也可能为临床诊断提供分子标记。波形蛋白属于Ⅲ型中间丝蛋白,是细胞骨架组成中除微管和微丝之外的第3组分[6]；从胞核到胞膜呈放射状分布,在维持和调节细胞正常形态和功能中起重要作用,如细胞收缩、迁移、增殖、蛋白合成、基因表达、细胞凋亡和机械力传导[7]。Tsuruta等[8]用黄色和蓝色荧光蛋白分别标记整合素β3和波形蛋白研究表明，波形蛋白通过与整合素β3形成黏着斑来影响细胞黏附。Ivaska等[9]进一步研究表明，波形蛋白与整合素的黏着与脱附是通过蛋白激酶Cε(PKCε) 的磷酸化与去磷酸化来调节的，以实现细胞移动,是细胞移动的参与者。上皮源肿瘤细胞中波形蛋白的高表达，可能使肿瘤细胞去分化而“显现”为更加原始“肿瘤祖细胞”，并促成EMT。借助或利用间质细胞来实现其侵袭转移[10]。

本研究发现，癌组织、癌旁组织标本及正常肝组织标本的波形蛋白的mRNA分别为8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00,差异有统计学意义(Plt;0.05)。癌组织，癌旁近临和癌旁近远组织样本里波形蛋白表达量分别为75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差异有统计学意义(Plt;0.05)。有学者详细论述了肿瘤细胞分泌外泌体作为“先锋兵”“教唆犯”介导组织器官微环境的改变，为肿瘤转移定植生长提供有利环境[11-12]。最新的研究表明，肿瘤细胞外泌体是通过诱导提高波形蛋白和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达，以促成EMT[13]。笔者推测：HCC细胞分泌肿瘤外泌体，向周围组织或血液等扩散，诱导波形蛋白等的表达，为肿瘤细胞的转移、侵袭准备物质基础，虽然此时肿瘤细胞还未侵袭到此处，表现为组织中波形蛋白表达随距离HCC组织的近远而逐渐降低；随着癌旁组织里波形蛋白表达逐渐增加，促成EMT，肿瘤细胞可能会随之侵袭到此处。因此，波形蛋白既可能是肝癌发生、发展及恶性程度某种特征因子，同时又是癌细胞转移侵袭的“铺路石”，通过癌细胞分泌泌外体的扩散，在癌旁组织里诱导其表达，越靠近癌组织泌外体的浓度越高，促其表达也越高，还有待于进一步深入的研究。现阶段研究表明，波形蛋白对于癌症患者的诊断依然有争论，波形蛋白的表达与癌症患者疗效不佳相关[14]；体外实验证明，细胞外基质与化疗药物密切相关，但是很多研究证实，波形蛋白不能够预计癌症患者术后的复发率及生存率[15]。

本研究显示，波形蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且其表达与TNM分期、病理分级、淋巴结转移、远处转移相关，与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤范围无关。波形蛋白在肝癌组织的高表达可能对肝癌有一定的促进作用，这与国内外大多数研究一致。但具体调节靶基因类型及其分子机制还需进一步探索。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.035

贵州省省校合作计划项目(黔科合LH字[2014]7118号)。

成超(1985-)，住院医师,硕士,主要从事肝胆外科方面的研究。△

，E-mail:2690527939@qq.com。

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1671-8348(2017)33-4714-04

2017-05-10

2017-08-08)