抚州市免疫儿童感染的HBV “a” 抗原决定簇变异分析

王 敏 周招华

南昌大学抚州医学院病原教研室；①第五附属医院检验科 江西抚州 344000

抚州市免疫儿童感染的HBV “a” 抗原决定簇变异分析

王 敏 周招华①

南昌大学抚州医学院病原教研室；①第五附属医院检验科 江西抚州 344000

①目的 研究抚州地区乙型肝炎免疫的儿童乙型肝炎患者HBV表面抗原区“a” 抗原决定簇变异特征。②方法 将抚州地区按照免疫规划程序按时按质接受乙肝疫苗接种的儿童设定为研究对象，收集多中心获得性乙肝免疫儿童血清标本8618份，采用ELISA法筛选HBV表面抗原(HBsAg)阳性样本，提取阳性标本中的HBV DNA，应用聚合酶链反应(PCR)体外酶促扩增HBV S基因片段，将扩增所得到的目的片段进行序列检测，并与参考序列对比，分析儿童感染的HBV血清亚型，确定变异株“a” 抗原决定簇的变异位点。③结果 从8618份血清样品中，检测出158 份HBsAg阳性标本(阳性率1.83%)。PCR成功扩增HBV S基因并测序135 份，112份属于B基因型，23份属于C基因型。B基因型中105份为adw血清型，7份为ayw血清型； C基因型均为adr血清型。分析发现16 份标本存在“a” 抗原决定簇变异(变异率11.85%)；16份标本的“a” 抗原决定簇 24个氨基酸位点中，有7个位点发生突变(突变率29.17%)；“a” 抗原决定簇两茎环间的变异率、基因型间的变异率无显著性差异(P>0.05)。④结论 在江西抚州地区乙肝疫苗免疫儿童人群中检测出HBV “a” 抗原决定簇变异株，但未见特异位点突变的免疫优势变异株。

乙型肝炎病毒 S抗原 变异 儿童

自乙型肝炎被纳入法定传染病范围以来，乙型肝炎病毒的免疫规划使得HBsAg携带率和乙型肝炎患病率明显降低[1]。但是获得性或者非获得性免疫容易诱导乙型肝炎病毒发生变异[2,3]。而任何形式的“a” 抗原点突变都能够引起其与抗-HBs亲和力的下降，进而导致免疫疫苗的失效，变异株的存在也增加了常规方法确诊乙型肝炎的难度，因为变异株会减弱原有抗原的活性，常规生化检测结果呈现出假阴性，实际患者本身已经感染乙型肝炎病毒。会无形中增加乙型肝炎病毒传染源及乙型肝炎病毒防控难度。本研究旨在分析抚州地区乙肝疫苗免疫儿童HBV的感染状况及免疫失败患儿HBV表面抗原区“a” 抗原决定簇变异特征。为本地区乙型肝炎的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病例来源 于2015年1～12月采集在南昌大学第五附属医院就医的儿童血清标本8618份，该人群平均年龄(8.34±3.26)岁。

1.1.2试剂 DNA提取液购自中山大学达安基因股份有限公司；HBV S基因扩增引物：正向引物F1: 5' cca cac gta gcg cct cat 3' (nt 2793-2810)，反向引物R1: 5' tta aat gta tac cca aag ac 3' (nt 837-818)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi)为Transgen生物科技有限公司(北京)产品。PCR扩增得到的目的基金产物交南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序比较。乙肝病毒六项(包括HBsAg, HbsAb,HBeAg, HBeAb, HbcAb,PreS-Ag)诊断试剂盒由上海邦奕生物公司提供。Clustal X 软件由欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute,Cambridge,UK)研发。Bioedit 是由美国宝蓝软件公司(Borland Software Corporation)开发。HBV基因分型采用美国NCBI在线Genotyping 软件。

1.2方法

1.2.1乙肝六项的测定 采用ELISA法参照各个诊断试剂盒的说明书。

1.2.2病毒DNA提取 在1.5mLEP管中加入患者血清50μL和50μLDNA提取液，振荡混匀5S，100 ℃恒温10分钟，12000转/分离心5分钟，上清备用。

1.2.3HBV S基因的扩增和测序 在0.5mLEp管中加入HBV DNA提取物 2μL，正、反向引物各1 μL，10×TransTaq HiFi Buffer 2.5 μL，2.5mM dNTP 2 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase 0.5μL，16 μL ddH2O，总体系为25μL。PCR参数： 94℃预变性5分钟；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，共35个循环；72℃再延伸10分钟。测序交试剂公司进行检测。

1.2.4HBV “a” 抗原决定簇序列、基因型和血清亚型分析 将数据录入Bioedit软件，并与参考序列比较；采用Toggle Translation 命令分析序列氨基酸位点突变。 血清型分别由表面抗原中122位和160位的赖氨酸(K)/精氨酸(R) 定为d/y和w/r亚型；将S基因序列输入Genotyping分析HBV基因型。

1.2.5统计学处理 所有数据统一录入Excel软件，并以此建立数据库，应用SPSS 13.0软件计算出效应指标，采用χ2检验法对不同组间指标差异进行统计学分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1乙肝六项的测定 对8618份血清样品进行生物检测，结果显示：158份血清样品中检测到乙肝表面抗原，即HBsAg阳性，其他标本均为阴性，检测阳性率为1.83%。

2.2PCR及其产物测序结果 HBV S基因PCR产物电泳结果显示,158份感染标本中135份[男75份，女60份，平均年龄(7.58±3.35)岁]标本能够扩增出约1200bp的目的条带，与预期结果一致。135份PCR产物测序序列均含HBV前S1基因、前S2基因和S基因序列。见图1。

注：M:DL 2000 DNA Marker 1-6泳道:PCR阳性血清标本 N:PCR阴性血清标本

图1 HBV S基因PCR产物电泳结果图

2.3HBV基因型和血清型 Genotyping比对结果显示，135份PCR产物中B型基因112份(94.9 2%)，与D00329序列同源性最高；C型基因23份(5.08%)，与M12906序列同源性最高。进一步对B基因型标本进行检测，结果显示adw血清型占105份，ayw血清型占7份；同样对23份C基因型进行检测，发现均为adr血清型。

2.4HBV “a” 抗原决定簇变异分析 所有序列均含有HBV S基因完整的“a” 抗原决定簇序列。与参考序列进行多重比对，发现16份“a” 抗原决定簇变异株，占比11.85%，变异率为11.85%。在“a” 抗原决定簇aa124～147间的24个氨基酸位点中， 有7个位点发生突变，变异率为29.17%。其中，9份标本变异发生在第一茎环内抗原表位，变异率为6.67%；7份标本变异出现在第二茎环抗原表位，变异率为5.19%。“a” 抗原决定簇两个茎环内的变异率差异不具有显著性(P>0.05)。见图2 ，表1。

图2 PCR产物 “a” 抗原决定簇的核苷酸序列与氨基酸序列

变异位点氨基酸置换例数(例)比率(占总突变数%)126T126A/I126S3/125.00127P127T16.25129Q129H318.75132S132T16.25142P142T16.25143S143T318.75145G145A318.75

检测不同性别间“a” 抗原决定簇变异情况，结果发现变异率分别为12.0%(9/75)和11.67%(7/60)，变异率差异无统计学意义(P>0.05，表2)。 基因型B和基因型C的突变率分别为11.61%(13/112)和13.04%(3/23)，变异率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同组间HBV “a” 抗原决定簇的变异差异比较

3 讨论

本研究调查的对象是接受过乙肝疫苗免疫，因不同疾病在医院不同科室就医的，通过血清HBV-M检测而筛查出的HBV 感染的抚州地区儿童人群。收集的8618份血清标本中，135份检测出HBsAg阳性，阳性率为1.83%，低于1992年文献报道的中国儿童HBV感染率(9.67%)，提示抚州地区乙型肝炎免疫规划成绩显著。但是我们并不能放松警惕，因为获得性或者非获得性免疫容易诱导乙型肝炎病毒发生变异[3,4]。任何形式的“a” 抗原点突变都能够引起其与抗-HBs亲和力的下降，进而导致免疫疫苗的失效，增加临床治疗的难度[4,5]。并且，接种免疫疫苗后容易降低自身的警惕性，自认为获得了对抗乙型肝炎病毒的免疫力。因此，对抗原变异位点的分析对于今后乙型肝炎免疫规划和临床治疗均具有指导意义。

基因序列进行分析结果显示，变异株共计16份，占比11.85%，明显高于1992年检测结果[6]。另外，检测不同性别间变异率差异无统计学意义，提示变异与性别无关联。因此，本研究对抗原变异位点的分析结果进一步验证了免疫接种可能诱导病毒的变异。而变异株的存在也增加了常规方法确诊乙型肝炎的难度，因为变异株会减弱原有抗原的活性，常规生化检测结果呈现出假阴性，实际患者本身已经感染乙型肝炎病毒。如果不加以控制会无形中增加乙型肝炎病毒传染源，增加乙型肝炎病毒防控难度。

HBV “a” 抗原决定簇由位于S蛋白中 aa124～aa147 的24个氨基酸构成，C124与C137以及C139与C147 二个分子间二硫键连接形成的双环结构是维持HBsAg 抗原结构的分子基础，是诱导产生抗-HBs的中和抗原表位。本研究检测的“a”抗原决定簇2个茎环内变异率无显著性差异。研究显示HBV “a”抗原决定簇2个茎环结构的免疫学性质存在差异，第一茎环表位(aa124～aa137)的变异多与病毒基因进化有关，其突变易导致抗原性发生改变[7]，而第二茎环表位(aa139～147)主要为中和抗体识别的靶位，其变异可能导致出现免疫逃避[8]。在本研究中，第一茎环表位中出现了4个位点的变异，变异率较高的位点分别是T126A/I126S和Q129H，变异率分别为25.00%和18.75%。第二茎环表位中有3个位点的变异，变异率较高的分别是S143T(18.75%)和G145A(18.75%)。较多的国外研究报道G145R变异与免疫逃避密切相关，本实验发现的该位点氨基酸变异为G145A与国内外的调查结果不同[9～12]，提示抗原突变不仅受到免疫接种的影响，可能还受到地区环境因素的干扰[13～15]。首先，不同地区经济和文化水平不同，使得人们对乙型肝炎病毒的认识有明显差异；其次，不同地区环境因素不同且生活习惯也有所差别，导致乙型肝炎病毒受到外部因素影响不同，可能会诱导产生不同的点突变。所以，区域化的研究对于笔者更加深入地了解乙型肝炎病毒的变异十分必要。

对抚州地区乙型肝炎病毒基因型进行分析，结果显示感染者多以B和C基因型为主，与国内其他研究基本一致[16]。进一步对其突变情况进行分析,结果显示两类基因型点突变的概率差异没有统计学意义(P>0.05)。提示两种基因均有发生点突变的可能，并且在干扰因素一致的情况下发生突变的可能性也是没有差异的。分析血清类型，结果显示血清型主要为adw。基于以上结果，笔者可以初步建立关于抚州地区乙型肝炎病毒变异株序列数据库，为本地区乙型肝炎的防治提供依据。但是，以上结果仅仅局限在儿童阶段。乙型肝炎病毒发病年龄广泛，可能不同年龄阶段乙型肝炎病毒亚型不同，其病毒株变异性情况也不同。因此，要想建立全面而准确的数据库，还需要获得更多不同年龄组病毒变异株序列数据。

综上所述，由于乙型肝炎病毒变异株的存在，使得本地区免疫儿童仍然可能被感染乙型肝炎病毒。因此，虽然目前免疫规划取得一定成绩，但是任务仍很艰巨。今后在免疫检测和疫苗研制的过程中，应该将乙型肝炎病毒株点突变因素考虑进去。此外，病毒株的变异还可能受到很多其他因素的干扰，整个突变和变异过程尚且不清楚，这就提示笔者今后应该继续密切关注，并能够纳入更多干扰因素了解乙型肝炎病毒株点突变过程，从而全面了解乙型肝炎病毒点突变的危险因素及点突变的位点，为今后乙型肝炎免疫规划和临床治疗提供依据。

[1] 吴俊发,兰武华.抚州市 1-4 岁儿童病毒性乙型肝炎血清学调查结果分析[J].公共卫生与预防医学,2008,19(3):13-15

[2] Bian T,Yan H,Shen L,et al.Change in Hepatitis B Virus Large Surface Antigen Variant Prevalence 13 Years after Implementation of a Universal Vaccination Program in China[J].J.Virol,2013,87(22):12196-12205

[3] 张 瑞,张现臣,朱凤才,等.乙型肝炎病毒“a”决定簇突变对乙型肝炎疫苗保护效果的影响[J].中华流行病学杂志,2007,28(4):334-337

[4] Katen SP,Tan Z,Chirapu SR,et al.Assembly-directed antivirals differentially bind quasiequivalent pockets to modify hepatitis B virus capsid tertiary and quaternary structure[J].Structure,2013,21(8):1406-1416

[5] Ie S I,Thedja M D,Roni M,et al.Prediction of conformational changes by single mutation in the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) identified in HBsAg-negative blood donors[J].Virology journal,2010,7(1):326-335

[6] Cooreman MP,Leroux-Roels G,Paulij WP.Vaccine-and hepatitis B immune globulin-induced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen[J].J Biomed Sci,2001,8(3):237-247

[7] Sureau C,Salisse J.A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A‐determinant[J].Hepatology,2013,57(3):985-994

[8] Kim JH,Gripon P,Bouezzedine F,et al.Enhanced humanization and affinity maturation of neutralizing anti‐hepatitis B virus preS1 antibody based on antigen-antibody complex structure[J].FEBS letters,2015,589(2):193-200

[9] Osiowy C.Detection of HBsAg mutants[J].J Med virol,2006,78(1):48-51

[10] 张 丽,颜丙玉,纪 峰,等.山东省人群乙型肝炎病毒“a”决定簇突变分析[J].中华实验和病毒学杂志, 2010,24(6):424-426

[11] Hsu HY,Chang MH,Ni YH,et al.Long-term follow-up of children with postnatal immunoprophylaxis failure who were infected with hepatitis B virus surface antigen gene mutant[J].Journal of Infectious Diseases,2013,207(7):1047-1057

[12] Mu SC,Lin YM,Jow GM,Chen BF.Occult hepatitis B virus infection in hepatitis B vaccinated children in Taiwan[J].J Hepatol 2009,50:264-272

[13] Caligiuri P,Cerruti R,Icardi G,et al.Overview of hepatitis B virus mutations and their implications in the management of infection[J].World journal of gastroenterology,2016,22(1):145-154

[14] Rehermann B,Bertoletti A.Immunological aspects of antiviral therapy of chronic hepatitis B virus and hepatitis C virus infections[J].Hepatology,2015,61(2):712-721

[15] Lin CL,Kao JH.The clinical implications of hepatitis B virus genotype:Recent advances[J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(1):123-130

[16] Shen YY,Hou W,Yang ZQ,et al.Hepatitis B virus infection and genotype in asymptomatic people from 10 ethnic groups in Yunnan,China[J].World journal of gastroenterology,2015,21(44):12586-12592

(2017-04-13 收稿)(王一伊 编辑)

Studyon“a”deteminantmutationofHBVinviralcarrierchildrenfollowinguniversalHBvaccinationinFuzhoucity

WANGMin，ZHOUZhaohua

(DepartementofPathogen,FuzhouMedicalCollegeofNanchangUniversity，Fuzhou344000，China)

ObjectiveThe study was to analyze the variaiton of “a” antigen determinant in the S antigen of HBV infecting the vaccinated children in Fuzhou area.Methods8618 serum from the children vaccinated with hepatitis B vaccine were collected. HBV-M was tested using ELISA. HBV DNA was extracted from the positive HBsAg serum for S gene amplification by PCR. The PCR products were sequenced and aligned with the reference sequences to analyze the mutation sites in HBV“a” antigen determinant. Genotype was determined using on-line genotyping software.Results158 samples were tested to be HBsAg positive out of 8618 serum with the positive rate of 1.83%. The S gene of 135 samples from 158 HBsAg positive serum were amplified and sequenced. 112 cases were determmined to be HBV genotype B, among which 105 cases belong to serotype adw and 7 of serotype ayw were found. The another 23 cases belonged to HBV genotype C and were serotype adr. 16 of 135 samples were found to carry site mutation in “a” determinant with the variation rate of 11.85%. Seven sites within the 24 amino acids spanning the “a” antigen region were mutated with the variation rate of 29.17%. The difference of mutation between two loops of “a” determinant, HBV genotype B and genotype C and male and female children were not different statistically(P>0.05).ConclusionThe HBV strains with mutations in “a” antigen determinant were detected in the infected children immunized with HBV vaccine. But immune dominant HBV strain of the mutation in a specific site was not found.

Hepatitis B virus.Surface antigen.Mutation.Children

R 37

A

2095-2694(2017)06-434-06

江西抚州市科技局科技项目(编号： 201602)。

王 敏(1979-),女,讲师，硕士。研究方向: HBV感染的研究。