缺血性脑卒中患者血浆同型半胱氨酸水平和MTHFR基因多态性分析

韩瑞玲，陈进，吴薇，李艳

缺血性脑卒中患者血浆同型半胱氨酸水平和MTHFR基因多态性分析

韩瑞玲，陈进，吴薇，李艳

目的：探讨缺血性脑卒中患者血浆同型半胱氨酸（HCY）水平和亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR多态性的关系。方法：缺血性脑卒中患者181例纳入卒中组，健康人126例纳入对照组。检测2组HCY、叶酸、VitB12水平、MTHFR基因多态性及一般情况，并分析不同基因型的脑卒中患者血浆HCY、叶酸、VitB12水平。结果：卒中组的HCY水平均显著高于对照组（P＜0.05），而VitB12、叶酸水平均显著低于对照组（P＜0.05）。卒中组MTHFR基因TT纯合子率及T等位基因频率均显著高于对照组（P＜0.05），而C/C野生型频率及C等位基因频率均显著低于对照组（P＜0.05）。卒中组MTHFR基因C/T杂合突变型及T/T纯合突变型HCY水平均显著性高于对照组，T/T纯合突变型叶酸水平显著性低于对照组（P＜0.05）。卒中组内T/T纯合突变型HCY水平显著高于C/C野生型及C/T杂合突变型，叶酸水平显著低于C/C型和C/T型（P＜0.05）。结论：缺血性脑卒中患者MTHFR基因677位点的纯合突变可能是血浆HCY水平升高的影响因素，叶酸、VitB12缺乏亦与HCY升高有关联。

同型半胱氨酸；MTHFR基因；缺血性脑卒中；基因多态性

高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinernia）已被公认为动静脉血栓形成的独立危险因素之一[1]。血浆同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）水平升高的主要原因有营养因素和遗传性因素，前者由于HCY代谢中的辅酶如叶酸、维生素B（Vitamin B，VitB）12或VitB6摄入不足，后者是因为HCY代谢相关酶基因突变所导致的代谢功能缺陷[2]，其中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的基因多态性与人体HCY的增高相关[3,4]。本研究通过对缺血性脑卒中患者血浆HCY、叶酸、VitB12浓度及MTHFR基因677位点多态性分析，为利用个体遗传特征进行缺血性脑卒中的预防和早期治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月至2016年12月在武汉大学人民医院神经内科住院的急性缺血性脑卒中患者181例为卒中组，汉族，无血缘关系。所有患者均符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南[5]诊断标准，并经颅脑CT和（或）MRI检查确诊。选择同期健康体检者126例为对照组，汉族，无血缘关系，均无脑梗死或其他脑血管病变，心电图正常。排除糖尿病、肿瘤、肝肾功能异常、甲状腺功能异常及血液病等患者，排除近1个月内服用甲氨蝶呤、叶酸、B族维生素及抗疟药物等影响HCY的药物者。

1.2 主要试剂和仪器

BR-526-24全自动杂交仪、BE-2.0生物芯片识读仪购于上海百傲科技有限公司，ADVIA Centaur XP全自动免疫分析仪购于德国西门子公司，T100 PCR仪购于美国Bio-rad公司。全血基因组DNA提取试剂盒、MTHFR基因检测DNA微阵列芯片法试剂盒购于上海百傲科技有限公司。HCY测定试剂盒、VitB12测定试剂盒、叶酸检测试剂盒购于德国西门子公司。

1.3 方法

1.3.1 血浆HCY、VitB12、叶酸浓度测定 受试者肘静脉采血2 mL（EDTA抗凝），离心分离血浆，－20℃保存。按照HCY、VitB12、叶酸测定试剂盒说明书，采用化学发光免疫竞争法分别测试受试者血浆样本中HCY、VitB12、叶酸浓度。

1.3.2 MTHFR基因分型检测[6]受试者经肘静脉采集外周血2 mL（EDTA抗凝），按照全血DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取和纯化。按照MTHFR基因检测DNA微阵列芯片法试剂盒说明书，使用生物素标记的MTHFR基因特异性荧光引物对已纯化的DNA标本进行PCR扩增。采用全自动杂交仪对PCR产物进行杂交及显色，随后用生物芯片识读仪及基因芯片图像分析软件（Baio Array Doctor V 2.0）判读MTHFR 677位点的等位基因，并定义为野生型（C/C）、杂合突变型（C/T）、纯合突变型（T/T）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，2组比较采用独立样本均数t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05认为差异具有统计学意义。采用Hardy-Weinberg平衡定律计算各等位基因频率分布数据的可靠性。

2 结果

2.1 2组基本情况比较

卒中组的收缩压水平及HCY水平均显著高于对照组（P＜0.05），而VitB12、叶酸水平均显著低于对照组（P＜0.05）。2组年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压患病率、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）及高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）差异均无统计学意义，见表1。

表1 2组一般情况比较

2.2 2组MTHFR基因分布频率比较

本研究卒中组MTHFR等位基因分布的频率符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），故认为群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体，见表2。MTHFR基因型多态性的总体分布情况见表3。卒中组MTHFR基因TT纯合子率及T等位基因频率均显著高于对照组（P＜0.05），而C/C野生型频率及C等位基因频率均显著低于对照组（P＜0.05）。

2.3 MTHFR基因多态性与血浆HCY、VitB12、叶酸水平的关系

本研究中卒中组MTHFR基因C/T杂合突变型及T/T纯合突变型HCY水平均显著性高于对照组，T/T纯合突变型叶酸水平显著性低于对照组（P＜0.05），见表4。卒中组内T/T纯合突变型HCY水平显著高于C/C野生型（P=0.011）及C/T杂合突变型（P=0.018），叶酸水平显著低于C/C型（P=0.001）和C/T型（P=0.011）。对照组内T/T纯合突变型HCY水平显著高于C/C野生型（P=0.048）及C/T杂合突变型（P=0.044），维生素B12水平显著低于C/C型（P=0.014），叶酸水平显著低于C/C型（P=0.001），见表4。

表2 卒中组MTHFR C677T基因Hardy-Weinberg遗传平衡分析

表3 各组MTHFR基因型及等位基因频率分布[例(%)]

表4 MTHFR基因多态性与血浆HCY、VitB12、叶酸水平（±s）

表4 MTHFR基因多态性与血浆HCY、VitB12、叶酸水平（±s）

注：与组内T/T比较，①P＜0.05

组别 例数HCY/(μmol/L)对照组卒中组t值P值126 181 C/C 10.66±4.69①14.68±4.12①1.439 0.188 C/T 10.44±3.27①16.10±4.34①2.329 0.048 T/T 17.11±5.76 26.30±10.85 2.829 0.022组别VitB12/(pg/mL)对照组卒中组t值P值C/C 555.51±114.37①397.11±119.70 2.139 0.065 C/T 502.78±73.96 386.94±128.49 1.747 0.119 T/T 371.87±109.01 262.35±105.64 1.613 0.145组别 叶酸/(ng/mL)对照组卒中组t值P值C/C 10.39±1.60①7.65±2.30①2.181 0.061 C/T 7.51±1.59 5.95±1.12①1.800 0.110 T/T 5.71±2.08 3.048±1.35 2.405 0.043

3 讨论

HCY是人体甲硫氨酸循环的中间产物，高HCY是脑血管病的独立危险因素。HCY的代谢需要MTHFR、叶酸、VitB12的共同参与。MTHFR是HCY代谢过程中的关键酶，可催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为N-5-甲基四氢叶酸，从而提供甲基使HCY甲基化为甲硫氨酸[7,8]，此过程还需要辅酶VitB12的参与[9,10]。因此，MTHFR活力下降及叶酸、VitB12缺乏均是导致HCY升高的重要原因。MTHFR功能缺陷或活性下降的主要原因为MTHFR基因的错义突变，最常见的基因多态性为677位点的C→T碱基突变，导致其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，酶活性降低，MTHFR的结构蛋白与叶酸结合能力下降，血浆HCY水平升高，增加了血栓形成风险。MTHFR基因677位点具有3种多态性（C/C、C/T、T/T），其中纯合突变型（T/T）编码的酶活性比野生型（C/C）编码的正常酶活性降低55%以上[11]，酶活性下降导致HCY水平不同程度升高。

本研究中，卒中组和对照组T/T型血浆HCY水平均显著高于本组C/C型和C/T型，说明T/T组MTHFR的酶活性最低，T/T突变是血栓性疾病的重要遗传性风险因素。这与北京[12]、河北[13]、重庆[14]、湖南[15]及印度[16]等地区报导一致。此外，陈素峰[17]等对浙江286例老年心脑血管病患者研究表明脑血管患者HCY显著升高，而与MTHFR基因多态性无显著关联，但该研究报导的MTHFR基因突变时叶酸水平明显下降与本研究相似，表明具有MTHFR基因多态性的患者应该注重补充叶酸及VitB12。本研究与这些报道不尽相同的原因在于脑血管疾病是多因素的，研究对象的遗传背景不同、饮食习惯不同及选择标准不同均有可能导致分析的差异。此外，本研究表明卒中组收缩压较对照组显著升高，这是因为病例组HCY过高引起的血管内皮损伤、抑制扩管物质一氧化氮和前列环素合成、降低动脉壁弹性、增加外周血管阻力等[18]，而叶酸、VitB12缺乏作为HCY升高的营养因素，在本研究中与收缩压升高显示出一定关联。由于本研究纳入的病例仅为武汉大学人民医院就诊的部分人群，存在一定的片面性，需要进行多地区大数据分析调查，才能取得更有价值的资料。

本研究表明MTHFR基因677位点的纯合突变可能是血浆HCY水平升高的影响因素，叶酸、VitB12缺乏亦与HCY升高有关。临床医生在条件允许的前提下，可以同时检测患者MTHFR C677T基因多态性及HCY水平，以结合遗传特征早期采取预防或治疗措施，实行个体化用药方案。

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The Relationship between Plasma Level of Homocysteine and Polymorphism Distribution of MTHFR Gene in Patients with Ischemic Stroke

HAN Rui-ling,CHEN Jin,WU Wei,LI Yan.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To investigate the relationship between the homocysteine(HCY)level and polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)gene in patients with ischemic stroke in Wuhan.Methods:One hundred and eighty-one stroke patients(stroke group)and 126 healthy volunteers(control group)were enrolled.The plasma levels of HCY,folic acid,VitB12and the MTHFR gene polymorphism were compared between the 2 groups.The plasma levels of HCY,folic acid and VitB12were compared among patients with different genotypes in the stroke group.Re⁃sults:The plasma level of HCY was significantly higher in the stroke patients than that in the control ones(P＜0.05).While the levels of folic acid and VitB12were significantly lower in the stroke patients than those in the control group(P＜0.05).There was a significant difference in the allele of the MTHFR gene in the T allele rate and T/T rate between the 2 groups(P＜0.05).In addition,the level of HCY in patients with homozygous mutant(T/T)and heterozygotes mutant(C/T)was significantly higher than that in the control group(P＜0.05).In stroke group,the level of HCY in homozygous mutant(T/T)was significantly higher than that of C/C wild type and C/T heterozygous mutant,and the level of folic acid of T/T was significantly lower than that of C/C and C/T(P＜0.05).Conclusion:MTHFR gene 677 locus homozygous mutation may be a factor for the increase of plasma HCY level in ischemic stroke patients,as well as the levels of folic acid and VitB12.

homocysteine;MTHFR gene;ischemic stroke;gene polymorphism

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.005

武汉大学人民医院检验科武汉430060

国家自然科学基金（No.81501427，81200389）湖北省自然科学基金资助项目（No.2016CFB456）

2017-05-27

李艳yanlitf1120@163.com

（本文编辑：唐颖馨）