无核葡萄杂交育种胚挽救技术程序

宋银花，章 鹏，贺亮亮，刘三军

(中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009)

无核葡萄杂交育种胚挽救技术程序

宋银花，章 鹏，贺亮亮，刘三军

(中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009)

无核葡萄是鲜食葡萄育种的一个重要方向。随着人们生活水平的不断提高,无核葡萄在鲜食和制干上显示出愈来愈重要的作用。在国际和国内市场中,销售量最大、最受人们欢迎的鲜食和制干品种主要是无核葡萄品种。我国无核葡萄干销量远大于有核葡萄干销量。

但目前无核葡萄品种少，现有的品种大多粒小、结实率低、无香味或香味不浓，有的成熟晚，抗病差，着色不良。因此需要培育出优质无核葡萄品种。

中国农业科学院郑州果树研究所葡萄育种课题组从20世纪60年代开始葡萄育种工作，已经培育出系列的无核品种和优系中葡萄4号、中葡萄18号等。

通过几年的实践工作，笔者初步总结出了无核葡萄品种杂交育种技术要点，以期为广大的葡萄杂交育种者提供参考。

1 葡萄父母本的选择

根据鲜食无核品种育种目标抗病、大粒、成熟期不同、颜色丰富、优质、耐贮、香味浓郁，来选择具有这些特征的父母本。

常规获得无核品种采用有核母本与无核父本杂交，获得后代，筛选无核优良单株。通过这种手段获得的无核优良单株比率很低(0～15.9%)。历来认为作为母本的有核品种应选用具有单性结实特点即有无核倾向的品种，这种品种最好是在家系中有无核品种介入者，而且这些品种的综合经济特性如果粒质量、糖酸含量、生长结果习性等都表现优良。

经验告诉我们用有核品种与无核品种杂交获得的优良杂种做有核亲本(母本)获得无核后代的可能性增大。父本应选择综合性状好的无核品种，以起源于无核黑和无核白的无核品种或品系做父本时后代分离出了较高比率的无核个体。

用无核母本与无核父本杂交，通过应用胚珠培养技术挽救无核葡萄的胚获得杂种。需要在母本胚停止发育前进行胚挽救，获得杂种实生苗。不宜选用那些胚过早发生败育的品种作母本，如无核白。

用于做父母本的树体一定要生长强壮。

2 花粉采集

采集父本开花前一天的花朵，把生长健壮、饱满的花穗采回室内，剥离花冠，取出花药，去除花丝，在自然条件下阴干，收集到干净的玻璃小瓶里，密闭置于阴凉干燥处，授粉时备用。

3 杂交授粉及套袋

开花前1～2天的早晨对母本去雄，去雄后，及时套袋，以防其他品种的花粉落入；花柱开始分泌黏液时，即“吐水”时，开始授粉，连续三天每天早晨9∶00以前授一次父本的花粉，每次授粉后及时套纸袋，最后一次授粉后再套尼龙袋以便标识。

4 果实采集

杂交果实如果具有完整的种子，去除果皮，洗干净种子，放入沙子中准备低温层积；

杂交果实中如果种子发育不完全，需要每周注意胚发育情况，在胚停止发育前，及时取回实验室，无菌处理，取出种胚，置于培养皿中，准备低温处理。

5 低温层积和低温处理

5.1 杂交种子的低温层积

将洗干净的葡萄种子与干净的河沙混合搅拌均匀，河沙的湿度以手握紧时成团，松开时散开为好，放于4℃的冷藏条件下层积，一直放到来年催芽时结束，中途需要查看沙藏的湿度，确保沙藏过程中适宜的温湿度，防止湿度大种子发霉。

5.2 种胚的低温处理

种胚放入培养皿中，马上进行低温处理，在4℃的冷藏条件下，低温冷藏60天左右，观察到有少数种胚开始发芽，接种到壮苗培养基中。

6 幼苗培育

6.1 杂交种子的培育

6.1.1 杂交种子催芽 第一年低温沙藏好的种子，第二年3月份天气回暖把沙子筛去，种子用自来水清洗干净，用低浓度的高锰酸钾溶液消毒杀菌，清洗干净，把喙切去。不同的父母本杂交后代喙的长短不同，以不损害到种子为原则。干净的毛巾用开水消毒，晾凉，平铺于干净的搪瓷盘上，把种子均匀铺于毛巾上面，种子上面覆盖一层干净的毛巾，然后撒上适量的水，水量以毛巾湿润，但不形成水流为宜。放入25℃生化培养箱进行催芽。

6.1.2 清洗、播种杂交种子 每天清洗一次种子，清洗前把发芽的种子捡出来播种到温室里，温室地温10℃以上，气温15～25℃，每天密切注意温度变化，及时进行保温或降温。基质以干净疏松的有机质为好，种子出芽快生长旺盛。种子播种到营养钵中。直到生化培养箱中催芽的种子少量发芽时，把没有发芽的种子播种在花盆中。

6.1.3 温室培养及锻炼 种子播种到营养钵中，注意保持适宜的温度和湿度。种子出土后，密切注意温湿度变化以及病害。种子出土2周后，开始炼苗，通风透光，让幼苗快速生长。幼苗在温室里生长一个月后，即可移入大田。

6.2 种胚成苗的培育

6.2.1 组培间接种、生根培养 将种胚接种到壮苗生根培养基中。放入组培间。当幼苗长到5～8厘米左右，具有5片以上叶片、根长达到2厘米以上、有三条以上主根，即可移入温室进行锻炼（图1）。

图1 组培间苗木培养

6.2.2 温室锻炼组培苗移栽 要求温室温度在15℃以上，最高25℃。组培瓶苗移入温室三天后去除绑绳，苗木初步适应外界环境；炼苗3天后，移栽组培苗。

组培苗的移栽成活率主要受栽培基质、环境湿度和温度影响。由于天气变化原因，尤其在组培苗适应温室环境这一阶段，需要精心管理。栽培基质要求干净无污染，质地疏松的有机质，能够保持适宜的湿度，利于组培苗快速生根（图2）。组培苗移栽后及时罩上塑料杯，以保持湿度，一周后逐渐去除塑料杯。温室内温度保持在15～25℃，移栽后一周内注意中午阳光照射不能强烈。

图2 组培苗移栽到有机质中保湿炼苗

6.2.3 适宜的温度、湿度、光照及适应环境 保持适宜的温度和湿度，合理浇水，适宜的光照，使胚挽救苗完全适应温室环境，然后正常的肥水管理即可（图3）。继续在温室生长一个月，即可移入大田。

图3 适应温室环境的组培苗

7 移入大田炼苗

大田炼苗通常株行距0.2米×0.5米，刚栽入大田时，需要精心管理，前期注意遮阴，保持适宜的温湿度。一周后即可进入正常的田间栽培管理，待到幼苗落叶后，挖苗保存，预防冻害、鼠害。

8 大田栽培前的准备与定植

准备定植杂交苗木的大田，挖宽60厘米，深80厘米的定植沟，表土与心土分开两边放置，定植沟底部放入秸秆，或腐熟的有机肥（鸡粪、猪牛羊粪及厩肥等），回填表土和心土，浇水下沉。

翌年定植于大田，通常株行距0.5米×2米，田间土肥水正常管理。准确记载父母本不同的杂交苗的定植顺序，制定准确的定植图。

9 结果与观察评价

对葡萄杂交苗的长期观察筛选是必不可少的。

葡萄杂交苗通常2～3年即可结果，结果后即可根据无核葡萄育种目标进行观察、记载、正确评价（图4）。

对表现优良的单株，需要3～5年重复观察。经过多年观察对表现稳定的优良单株即可进行区域试验。

对优良单株进行采集种条，繁育苗木，进行多点多年区域试验，对于表现优良的单株即可进行品种审定等工作。

图4 大田中栽培的杂交苗

河南省科技攻关项目“无核、耐储运、优质抗性葡萄新品种及配套关键技术研究”(162102110079);中国农业科学院创新工程“葡萄资源与育种”(C AAS-ASTI P-2017-ZFR I);中国农业科学院基本科研业务费专项“葡萄绿色增产增效技术集成与示范”(1614572017207)