HPLC法同时测定绿咖啡豆中绿原酸及咖啡碱含量

王光路，李长文，，刘志达，刘顺航，徐咏全，*

（1.天士力控股集团有限公司研究院，天津300410；2.云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司，云南普洱665000）

HPLC法同时测定绿咖啡豆中绿原酸及咖啡碱含量

王光路1，李长文1，2，刘志达2，刘顺航2，徐咏全1，*

（1.天士力控股集团有限公司研究院，天津300410；2.云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司，云南普洱665000）

建立一种高效液相色谱法（HPLC），可同时定量绿咖啡豆中绿原酸和咖啡碱的含量，并分析不同成熟度绿咖啡豆中绿原酸和咖啡碱含量变化。采用Agilent ZORBAX ODS-C18色谱柱，以0.5%乙酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱，检测波长274 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温35℃。结果显示，绿原酸和咖啡碱的浓度线性范围分别为5.0 mg/L～100.0 mg/L（r2=0.999 9）和 5.1 mg/L～101.6 mg/L（r2=0.999 9），检出限分别为 0.25 mg/L 和 0.05 mg/L，相对标准偏差分别为1.56%和1.30%，回收率范围分别为98.86%～101.11%（RSD=1.02%）和98.70%～101.19%（RSD=0.83%）。

绿咖啡豆；绿原酸；咖啡碱；高效液相色谱法（HPLC）；含量

绿咖啡豆是茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）小粒咖啡（Coffea arabica）、中粒咖啡（Coffea robusta）及大粒咖啡（Coffea liberica）的种子[1]，含有丰富的活性物质，其中绿原酸类物质可以占到咖啡豆干重的4%～14.4%[2-3]，而咖啡碱约占1%～2%[4]。绿咖啡豆中绿原酸共有9种同分异构体[5]，其中以5-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）为最多，约达到总含量的56%～62%[6]。绿原酸的多种药理作用如抗氧化[7]、抗病毒[8]、抗癌[9]、抗肿瘤[10]、降糖[11]及消脂[12]等，已被科学界所证实。而咖啡碱，在医药上可作麻醉剂、兴奋剂、利尿剂和强心剂[13]，但大剂量或长期使用可引起阵发性惊厥，损害肝、胃、肾等重要内脏器官。因此，绿原酸及咖啡碱的含量检测是绿咖啡豆产品质量控制的关键。

目前，有多篇文献[14-16]研究了咖啡豆中绿原酸或咖啡碱单一成分的检测，但是针对绿咖啡豆中绿原酸和咖啡碱的同时检测鲜有报道。Fujioka报道了一种同时检测咖啡中绿原酸和咖啡碱的方法[17]，但需采用多波长检测器；杨青山等[18]建立了一种咖啡豆中绿原酸和咖啡碱的超高效液相色谱测定方法，虽然该方法简单、快速，但是对检测设备要求高，对于中小型企业，并不适合推广应用。

本试验在杨青山等[18]研究基础上，建立了同时测定绿咖啡豆中绿原酸和咖啡碱的高效液相色谱法，本法操作简便、快速，检测设备要求低，结果准确，适用于绿咖啡豆的质量控制。此外，使用上述方法，本研究还分析了绿咖啡豆在不同成熟期的绿原酸和咖啡碱含量变化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪：美国Agilent公司；AB135-S电子分析天平：梅特勒公司；Mill-Q超纯水净化系统：美国Millipore公司；KQ-250E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FW100万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DGG-101-1电热鼓风干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司。

咖啡鲜果（小粒咖啡）：云南省普洱市农户采收；绿原酸标准品（纯度96.2%）：中国食品药品检定研究院；咖啡碱标准品（纯度≥98%）：天津马克生物技术有限公司；冰醋酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（分析纯）：天津市康科德科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同成熟度绿咖啡豆预处理

绿咖啡豆采收于固定的3株咖啡树，采收后混匀，迅速冷藏并邮寄至天津，采收时间为每月二十号。

绿咖啡豆预处理：1）将不同成熟度绿咖啡豆进行烘干，30℃鼓风干燥8 h；2）手工将绿咖啡豆外果皮（含果肉）和内果（含胶质层、内果皮以及胚乳等）进行剥离；3）将分开的外果皮和内果，分别再次烘干，40℃鼓风干燥6 h；4）将内果部分去除内果皮（羊皮纸层），即得绿咖啡豆，备用；

1.2.2 标准品溶液制备

分别精密称取绿原酸和咖啡碱标准品10.00 mg和10.16 mg，用70%甲醇溶解于100 mL容量瓶，室温下超声处理10 min，定容摇匀作为储备液，浓度分别为100.0 mg/L和101.6 mg/L；使用70%甲醇分别稀释1.25、2.5、5、10、20 倍，作为梯度标准工作液，过 0.45 μm滤膜备用。

1.2.3 供试品溶液制备

根据文献[18]报道方法，将1.2.1中咖啡豆粉碎至40目通过率80%以上细度，将筛上物和筛下物混合均匀后，作为待测样；参考文献[18]和国家标准GB/T 22250-2008《保健食品中绿原酸含量测定》中方法进行超声提取，即准确称取0.500 g待测样，置于50 mL容量瓶中，加入45 mL 70%甲醇溶液，室温超声提取1.5 h，冷却后定容，定容液稀释10倍过0.45 μm滤膜，进样检测。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：274 nm；进样量：10 μL；流动相 A：0.5%乙酸水溶液，流动相B：色谱乙腈；梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱表Table 1 The table of gradient elution

2 结果与分析

2.1 液相条件的确定

2.1.1 梯度洗脱确定

绿原酸和咖啡碱分别具有弱酸性和弱碱性，文献称[19]流动相中乙酸浓度对两者的分离有一定影响，因此本试验参考了GB/T 22250-2008《保健食品中绿原酸含量测定》和2015年版《中国药典》第一部金银花中绿原酸含量测定，进行梯度洗脱：0～40 min，0.5%乙酸水溶液比例变化为 95%～70%；40 min～45 min，0.5%乙酸水溶液比例变化为70%～95%。结果发现，20 min内绿原酸和咖啡碱可以得到很好分离，之后并无其他物质出峰，因此确定梯度洗脱比例如下：0～20 min，0.5%乙酸水溶液比例变化为95%～80%；20 min～25 min，0.5%乙酸水溶液比例变化为80%～95%。

2.1.2 检测波长验证

已知咖啡碱最大吸收波长为272 nm，绿原酸最大吸收波长为327 nm，根据文献报道[18-19]，发现在274 nm波长条件下，绿原酸和咖啡碱均具有吸收。因此本试验在3个波长下，分别对绿原酸和咖啡碱混合标准液进行分析（单标分析数据未列出）。不同波长下绿原酸和咖啡碱标准液色谱图见图1。

图1 不同波长下绿原酸和咖啡碱标准液色谱图Fig.1 Chromatograms of chlorogenic acid and caffeine at different wavelengths

从图1-A1、1-A2、1-A3可知，绿原酸出峰时间为15.65 min，在327 nm下吸收最大，检测峰面积最高，在274 nm下次之，272 nm下最低；而咖啡碱在327 nm下无吸收，274和272 nm下，检测峰面积接近，出峰时间为18.00 min。因此，本方法选择波长274 nm进行检测。使用该波长对绿咖啡豆提取液进行检测，检测色谱图见图1-B1。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系及检出限

取1.2.2中绿原酸和咖啡碱标准品溶液，按1.2.4条件检测，进行线性范围考察，分别以绿原酸和咖啡碱质量浓度X（mg/L）为横坐标，其对应峰面积Y为纵坐标，进行回归分析，得到绿原酸和咖啡碱的线性回归方程，结果见表2。结果表明：绿原酸在5.0 mg/L～100.0 mg/L时峰面积和浓度成良好线性，r2=0.999 9；咖啡碱在5.1 mg/L～101.6 mg/L时峰面积和浓度成良好线性，r2=0.999 9。以3倍信噪比（S/N≥3）计算方法的检出限（LOD）。

2.2.2 精密度试验

取1.2.2中绿原酸和咖啡碱标准品溶液，按1.2.4条件检测，进行精密度试验，重复进样5次，测定峰面积结果表明：标样中绿原酸和咖啡碱的相对标准偏差分别为0.20%和0.05%（n=5），结果表明，仪器精密度良好。

表2 绿原酸和咖啡因的线性范围、线性关系及检出限Table 2 The linear range，linear relation and LODs of chlorogenic acid and caffeine

2.2.3 重复性试验

选取同一份样品，按1.2.3中方法制备5份供试品溶液，进行重复性试验，分别测定色谱峰面积，计算样品中绿原酸和咖啡碱含量分别为43.38 mg/g和11.37 mg/g，RSD 分别为 1.56%和 1.30%（n=5），结果表明，本法重复性良好。

2.2.4 回收率试验

取同一批已知绿原酸和咖啡碱含量的绿咖啡豆样品，分成3组，分别加入其含量0.8、1.0和1.2倍的标准品溶液，按所建立的方法进行样品处理和测定，结果表明：绿原酸的回收率为98.86%～101.11%（RSD=1.02%），咖啡碱的回收率为98.70%～101.19%（RSD=0.83%），说明该样品提取方法可行，检测结果准确。

2.3 不同成熟度绿咖啡豆分析

连续跟踪咖啡结果期5个月，分别挑选不同成熟度的绿咖啡豆，按1.2.1方法进行样品处理，处理过程见图2。按1.2.3和1.2.4建立的方法，对干燥后的绿咖啡豆进行提取，分别检测绿原酸及咖啡碱含量，结果见图3。

图2 不同成熟度的绿咖啡豆处理过程Fig.2 The treatment process of raw coffee beans with different maturity

图3 不同成熟度绿咖啡豆中绿原酸及咖啡碱含量变化Fig.3 The chlorogenic acid and caffeine contents in raw coffee beans of different maturity

可以看出，随着成熟度的增加，绿咖啡豆中绿原酸含量先快速升高，11月份达到峰值，之后呈现降低趋势；而咖啡碱含量，在9月份之后相对稳定。

3 结论

本研究建立了一种绿咖啡豆中绿原酸及咖啡碱的同时定量方法，并使用该方法初步分析了不同成熟度绿咖啡豆各成分含量变化。结果表明，绿原酸和咖啡碱的线性关系、检出限、精密度、重复性以及加标回收率等都满足检测需求，方法简便、快速，检测设备要求低，结果准确，适用于绿咖啡豆中绿原酸和咖啡碱含量的测定，可广泛应用于绿咖啡豆产品的质量控制。此外，经连续跟踪分析发现，随着成熟度的增加，绿咖啡豆中绿原酸含量先快速升高，达到峰值后呈现降低趋势，而咖啡碱含量相对稳定，该结果可为绿咖啡豆的采收提供参考。

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Simultaneous Quantitative Analysis of Chlorogenic Acid and Caffeine in Raw Coffee Beans by HPLC

WANG Guang-lu1，LI Chang-wen1，2，LIU Zhi-da2，LIU Shun-hang2，XU Yong-quan1，*
（1.Tasly Academy，Tianjin 300410，China；2.Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co.，Ltd.，Puer 665000，Yunnan，China）

A high performance liquid chromatography method was developed for simultaneous determination of chlorogenic acid and caffeine in raw coffee beans.The chlorogenic acid and caffeine contents in raw coffee beans of different maturity were analyzed.The separation was performed on a Agilent ZORBAX ODS-C18 column with a gradient elution system.The mobile phase consisted of 0.5%acetic acid solution and acetonitrile.The detection UV wavelength was at 274 nm.The flow rate was 1.0 mL/min.The injection volume was 10 μL.The column temperature was 35℃.The results showed that the linear ranges of chlorogenic acid and caffeine were 5.0 mg/L-100.0 mg/L （r2=0.999 9）and 5.1 mg/L-101.6 mg/L（r2=0.999 9），respectively.The limits of detection（LOD）were 0.25 mg/L and 0.05 mg/L，respectively.The RSDs of the method were 1.56%and 1.30%.The spiked recoveries of the two analytes were 98.86%-101.11%（RSD=1.02%）and 98.70%-101.19%（RSD=0.83%），respectively.

raw coffee bean；chlorogenic acid；caffeine；high performance liquid chromatography（HPLC）；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.030

王光路（1987—），男（汉），研究员，硕士，研究方向：普通食品及保健食品研发。

*通信作者：徐咏全，高级工程师，硕士。

2017-04-12