拐枣中齐墩果酸含量的测定

王志强，罗锦霞，李维嘉，蔡大川，林晨，梁洁怡

（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

拐枣中齐墩果酸含量的测定

王志强，罗锦霞，李维嘉，蔡大川，林晨，梁洁怡

（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

建立拐枣中齐墩果酸的含量测定方法。采用紫外分光光度法，对显色剂用量，稳定剂用量，水浴显色时间，稳定时间等因素分析最佳测定方法。结果表明：齐敦果酸提取的最佳试剂为75%的乙醇，以0.4 mL 50 g/L香草醛-冰醋酸为显色剂，0.8 mL高氯酸为稳定剂，70℃水浴反应25 min，在540 nm下测定吸光度得到齐墩果酸含量为4.72%，此方法为最佳测定方法。

拐枣；齐墩果酸；紫外分光光度法；提取；含量测定

拐枣，学名枳椇子，为鼠李科植物的带肉质果柄的果实，其子实称为枳椇子。分布安徽、浙江、江西、广东、福建、湖北、湖南、广西、陕西、四川、贵州、云南等省区，河南也有栽培。枣属落叶乔木，高达10 m多；嫩枝、幼叶背面、叶柄和花序轴初有短柔毛，后脱落。叶片椭圆状卵形、宽卵形或心状卵形，长8 cm～16 cm，宽6 cm～11 cm，顶端渐尖，基部圆形或心形，常不对称，边缘有细锯齿，表面无毛，背面沿叶脉或脉间有柔毛。两义式聚伞花序顶生和腋生；花小，黄绿色，直径约4.5 mm；花瓣扁圆形；花柱常裂至中部或深裂。果柄肉质扭曲，呈红褐色；果实近球形，无毛，直径约7 mm，灰褐色。果实形态似万字符，故称万寿果[1]。拐枣具有很高的保健功效，如解酒作用、保肝活性作用、抗肿瘤作用、抗衰老作用、降压利尿作用、镇静镇痛作用[2]。果柄含多量葡萄糖和苹果酸钾，经霜后甜，可生食或酿酒。药理表明：三萜类和黄酮类为该属植物的活性成分，具有抗甜味、抑制组胺释放和保肝解救等作用[3]。

目前国内外对拐枣的研究相对较少，至今对其化学成分研究局限于黄酮类和多糖类的研究[4-7]，对其三萜类物质的含量研究主要也集中在三萜皂苷类物质的研究[8-9]，现就拐枣中三萜类化合物齐墩果酸的提取及含量测定进行研究[10-15]，对其三萜类化合物的开发利用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 主要材料

拐枣为采集新鲜的野生拐枣，洗净、晾晒、粉碎、过筛后，在105℃烘干至恒重，干燥器内保存备用。

齐墩果酸标准样品（91.7%）：中国食品检定研究院；香草醛：阿拉丁试剂；冰醋酸、高氯酸、乙醇、三氯甲烷等：广州化学试剂厂，分析纯级；实验室用水为去离子水。

1.2 主要仪器

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；HWS24型电热恒温水浴锅、DHG-9245A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 标准溶液的配置

精密称取齐墩果酸标准品，溶于乙醇溶液，配置成0.214 8 mg/mL的标准溶液。

2.2 最大波长的选择

取配置好的标准溶液0.4 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入显色剂（50 g/L的香草醛冰醋酸溶液）和的稳定剂（高氯酸）反应后，在可见光区进行扫描，确定最大吸收波长。

2.3 显色剂用量的选择

取6份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，分别加入 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的显色剂和0.8 mL的稳定剂，在70℃水浴下反应2 min，冰水冷却，加入5 mL冰醋酸，在540 nm下测定吸光度。

2.4 稳定剂用量的选择

取7份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，分别加入 0.4 mL 的显色剂和 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的稳定剂，在70℃水浴下反应25 min，冰水冷却，加入5mL冰醋酸，在540nm下测定吸光度。

2.5 水浴温度的选择

取5份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.4 mL的显色剂和0.8 mL的稳定剂，分别在 50、60、70、80、90 ℃水浴下反应 25 min，冰水冷却，加入5 mL冰醋酸，在540 nm下测定吸光度。

2.6 显色时间的选择

取5份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.4 mL的显色剂和0.8 mL的稳定剂，在70 ℃水浴下，分别反应 5、10、15、20、25、30、35、40 min，冰水冷却，加入5mL冰醋酸，在540nm下测定吸光度。

2.7 标准曲线的测定

吸取配置好的标准溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.4 mL的显色剂和0.8 mL的稳定剂，在70℃水浴下反应25 min，冰水冷却，加入5 mL冰醋酸后，在540 nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。

2.8 测试方法的评价

2.8.1 测试方法的稳定性

取5份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.4 mL的显色剂和0.8 mL的稳定剂，在70℃水浴下反应25 min，冰水冷却，加入5 mL冰醋酸后，分别稳定 10、20、30、40、50、60 min 后，在 540 nm下测定吸光度。

2.8.2 测试方法的精密性

取5份0.4 mL的标准溶液于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.4 mL的显色剂和0.8 mL的稳定剂，在70℃水浴下反应25 min，冰水冷却，加入5 mL冰醋酸后，在540 nm下测定吸光度。

2.9 样品分析测试

取250 mL的磨口锥形瓶，精密称取1 g烘干至恒重的试样于其中，分别加入40 mL三氯甲烷、75%乙醇、75%甲醇、水，置于沸水浴中回流2 h，冷却过滤后，再用40 mL相应的试剂将滤渣洗入锥形瓶中继续水浴2 h后，冷却过滤，收集两次滤液于100 mL容量瓶中，定容进行紫外分析测试。

2.10 样品加标回收率

将一定量的齐墩果酸标准溶液加入到拐枣试样中，按最佳提取试液进行提取后，按确定方法要求进行测试。

3 结果与分析

3.1 最大波长的确立

将标准溶液在紫外可见光区扫描，结果如图1，结果表明溶液在540 nm处有最大吸收。因此，选540 nm作为测定方法波长。

图1 齐墩果酸标准溶液的光吸收曲线Fig.1 Ultaraviolet absorption speatrum of oleanolic acid

3.2 显色剂用量的确定

不同用量的显色剂测得吸光度变化如图2。

图2 显色剂用量对吸光度影响Fig.2 The effect of the amount of the developer on the absorbance

结果显示显色剂用量在0.4 mL时吸光度达到最大，显色效果最好，确定方法选用0.4 mL的显色剂。

3.3 稳定剂用量的确定

不同用量的稳定剂测的吸光度变化如图3。

图3 稳定剂用量对吸光度影响Fig.3 Effect of stabilizer on absorbance

结果显示稳定剂在0.8 mL时吸光度达到最大，确定方法选用0.8 mL的稳定剂。

3.4 水浴温度的确定

不同水浴温度下测得的吸光度变化如图4。

结果显示在50℃～70℃的水浴温度下吸光度变化平稳，在70℃时稳定在一个较好的吸收范围，大于70℃后，吸光度突增，反应产物发生转变，因此确定方法选用水浴温度为70℃。

图4 水浴温度对吸光度影响Fig.4 The effect of water bath temperature on absorbance

3.5 显色时间的确定

在显色时间不一样的条件下吸光度的变化如图5所示。

图5 显色时间对吸光度影响Fig.5 The effect of color development on absorbance

显色时间在25 min时达到最佳，确定方法选用25 min的显色时间。

3.6 标准曲线的绘制

在540 nm处，测得各标准系列溶液的吸光度如图6。

图6 齐墩果酸标准溶液曲线Fig.6 The standard cueve of deanolic acid

以齐墩果酸含量对吸光度作回归处理，得回归方程：Y=0.006 9X+0.044 1，相关系数 R2=0.998 9，线性良好。

3.7 测试方法的稳定性

标准试样在不同稳定时间点的吸光度如表1，结果显示在60 min内基本稳定，RSD=1.8%，具有较好的稳定性。

表1 测定方法的稳定性Table 1 The stability of the assay method

3.8 测定方法的精密性

将相同浓度的标准试样多次测定后结果见表2，分析得出方法的精密性较好，RSD=1.2%。

表2 测定方法的精密性Table 2 The precision of the assay method

3.9 不同提取溶剂对拐枣中齐墩果酸的提取

拐枣试样在三氯甲烷、75%乙醇、75%甲醇、水溶剂下提取效果如表3，分析得出75%乙醇溶液提取试液的齐墩果酸含量最高。

表3 不同溶剂提取试样得出齐墩果酸的含量Table 3 Theoleanolic acid content was obtained by extracting the samples with different solvents

3.10 加标回收率

加标回收结果如表4，得出回收率为96.6%，RSD=1.2%。表明试样方法满足加标回收。

4 结论

通过对拐枣中齐墩果酸的不同提取试剂和影响含量测定的因素进行分析，结果显示，各个因素对齐墩果酸的含量测定影响较大，提取的最佳试剂为75%的乙醇，含量测定的条件为0.4 mL的香草醛显色剂，0.8 mL的高氯酸稳定剂，水浴时间为25 min，水浴温度70℃，测定波长为540 nm。在此条件下提取的拐枣中的齐墩果酸含量为4.72%，且精密性和稳定性较好。拐枣中三萜类化合物的定性分析鉴别还有待进一步研究。

表4 回收率试验结果Table 4 Recovery test results

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Determination of the Content of Oleanolic Acid in Turnjujube

WANG Zhi-qiang，LUO Jin-xia，LI Wei-jia，CAI Da-chuan，LIN Chen，LIANG Jie-yi
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，China National Analytical Center，Guangzhou，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

A method for the content determination of oleanolic acid in turnjujube was established.Ultraviolet spectroscopy，which was the best method for the content determination of color reagent and stabilizer，the coloration time of water bath and reagent and stabilizer time.The results indicated that，for the oleanolic acid，ethanol solution（75%）was found to the best extraction reagent，Vanillic aldehydet（0.4 mL，50 g/L）acetic acid was used as color reagent.Perchloric acid（0.8 mL）was used as the stabilizer，all the reactants were conducted in water bath at 70℃for 25 minates.Then the absorbance of the oleanolic acid was measured under 540 nm.Finally，the content of oleanolic acid was determined to be 4.72%.This method was determined to be the optimum method.

turnjujube；oleanolic acid；UV spectrophotometry；extraction；determination of content

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.026

广东省省级科技计划项目（2013B091604003、2014B070705001）

王志强（1986—），男（汉），助理研究员，本科，研究方向：食品分析测试。

2017-04-20