食品级过氧化氢在细胞水平的毒理学研究

丁宇，杨磊，王晨光，田恺，刘凤娟，于燕燕

（天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心，天津300308）

食品级过氧化氢在细胞水平的毒理学研究

丁宇，杨磊，王晨光，田恺，刘凤娟，于燕燕

（天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心，天津300308）

过氧化氢作为强氧化剂的代表物之一，被广泛应用于食品工业，起到防腐、漂白、除臭等作用。而食品中残留及非法添加的过氧化氢对消费者健康存在着严重危害。近年来，细胞毒理学作为一门热门学科，用于研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制，从而进行食品安全性分析，具有准确、快速、经济等特点，在食品安全检测和研究领域具有良好的应用前景。利用细胞形态学变化以及细胞凋亡检测技术研究食品级过氧化氢的危害。

过氧化氢；细胞毒理学；食品安全

过氧化氢（H2O2）以其优良的氧化、漂白、消毒作用，广泛运用在各类化工、食品、纺织、医药、电子及环境保护等领域[1]。近年来，随着我国食品行业不断发展，食品级过氧化氢在食品领域中的矿泉水、乳品、饮料、水产品、水果、啤酒等食品生产过程中广泛运用。由于利益驱使及监管不足的内外因素，导致其在食品工艺中存在超标添加的问题，进而引发各类食物中毒事件。例如利用过氧化氢加工鸡爪、泡椒鱼皮、漂白开心果等。按照我国近年所颁布的食品添加剂运用标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，过氧化氢在达到食品级别的要求下，可用于食品加工制备，不过在制成出售前，要求能及时清除，并严格检测，只有在其含量达标的情况下，才可以销售。

在发达国家，过氧化氢的使用在剂量、使用范围、都受到严格监督。在我国，当前百姓越来越关注健康问题，对于各类食品添加剂的残留也越来越重视，众多实验证实，一旦人体摄入过量的过氧化氢，必定会造成身体的伤害，包括对细胞的损害，加速人体衰老、及引发器官癌变等[2]，尤其是其能产生过量的羟基自由基，将参与到人体内的羟基化反应及电子转移，造成人体细胞的坏死或病变，从而危害人体健康，属于毒性各类毒性中的最大自由基。

相关研究显示，过氧化氢的检测方式很多，包括化学滴定法、分光光度法、高效液相色说来法、荧光光度法、电化学分析法等[3-4]。近年来，随着细胞水平毒理学检测与研究逐渐兴起，通过对外源性毒害因子所产生的致癌性，对机体细胞毒性和特异细胞毒作用、毒物代谢及其毒效应的作用机制的等方式，来开展药物筛选、食品安全性分析。此外，细胞培养还将对功能食品的效果成分展开毒性评价[5-8]。现阶段，有关细胞毒理学已在食品界获得广泛运用，细胞毒理学透过离体培育的细胞不仅能用作研究目标毒物对于靶细胞毒性和其毒物于细胞内展开的生物转化[9-10]。还可用作研究目标毒物对靶细胞的功能，通过细胞毒理学有助于有效评价食品安全性，达到检测食物中的毒素、重金属及农药残留、添食品加剂等[11-13]。

本文利用细胞毒理学中的细胞形态学变化以及细胞凋亡检测技术研究食品级过氧化氢的危害。

1 材料

1.1 材料与试剂

无钙台氏液：135 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5.5 mmol/L葡萄糖，用NaOH溶液调至pH7.4；含钙台氏液：于无钙台氏液中加进CaCl2至1.8 mmol/L；KB液：50 mmol/L聚谷氨酸，40 mmol/L KCl，20 mmol/L 牛磺酸，20 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），3 mmol/L MgCl2，以 KOH 溶液调pH7.4；胶原酶、蛋白酶：日本公司 Yakult公司；H2O2、5，5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）：Sigma Aldrich公司。

1.2 仪器

Facscan流式细胞仪：美国Dickinson公司；HHS电热恒温水浴锅：天津市华北实验仪器有限公司；FV300激光扫描共聚焦显微镜：日本Olympus公司；311A细胞培养箱：日本ESPC公司；3K15离心机：德国sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌细胞分离

试验选择选用健康成年豚鼠（300 g～400 g），1%戊巴比妥钠按进行腹腔注射麻醉后，取出心脏并将主动脉连于Langendorff灌流装置中，维持37℃恒温及供氧条件以含钙台氏液连续灌流约3 min（冲洗心脏内残血，予以细胞更加充裕的氧），无钙台氏液灌流约6 min（解除心肌细胞内桥粒与连接），以含0.05%胶原酶无钙台氏液灌流到心室肌组织被消化（解离细胞间结缔组织）；以KB液灌流冲洗并剪碎其中的心室肌组织，再机械分散至单个细胞，接着以滤网进行过滤，再以0.002 5%蛋白酶孵育3 min；离心3次（每次3 min）；所得细胞存储在KB液，将温度调至4℃保存。

1.3.2 细胞钙瞬变的测定

将制备而成豚鼠心肌细胞内加进二甲基亚砜（DMSO）溶液，将其稀释至 25 μmol/L 的 Fluo-340 μL染色，此后将培养皿放置在37℃水浴箱内，避光水浴30 min后，加进无钙液400 μL冲洗2次；通过激光扫描共聚焦显微镜，于视野下找出细胞（挑选出其中形态良好、染色程度最好的），以该显微镜展开实时监测心肌细胞产生的荧光值变化并记录下来，即为钙离子的浓度变化。

参数设置为：激发波长（λex）488 nm，发射波长（λem）520 nm。分别加进浓度5 mmol/L的过氧化氢10、20、30μL，通过氧化氢终浓度：0.125、0.25、0.375 mmol/L，运用Time Coursw程序进行平面扫描，各试验组均扫描60张，每张间隔10 s，持续性观察各试验组500 s内钙离子荧光强度（FI）产生的变化情况。

1.3.3 细胞凋亡率

将心肌细胞接种于24孔培养板内，随机分成NC组，0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2处理组，分别作用 1、3、6、12 h，随后通过（AO/EB）染色法展开检测。用倒置荧光显微镜进行拍照，通过200个细胞计算凋亡率。

1.3.4 数据处理

将每10秒所对应钙离子荧光值减掉基线钙离子荧光值，所获得的数据作为某时钙瞬变荧光强度，取其中50个时间点并计算平均值，代表钙瞬变荧光强度值。透过统计学处理，正态分布计量资料以均值±标准差表示，针对多样本比较运用单因素方差法展开分析，以P<0.05代表具统计学意义。

2 结果与分析

2.1 心肌细胞钙瞬变

不同浓度H2O2对豚鼠心肌细胞钙瞬变影响见表1、图 1。

表1 不同浓度H2O2对豚鼠心肌细胞钙瞬变影响Table 1 Different concentrations of H2O2induced Intracellular Ca2+transient

图1 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2对豚鼠心肌细胞钙瞬变Fig.1 Intracellular Ca2+transient induced by 0.1，0.25，0.5 mmol/L H2O2

由表1可见，在加入3种不同浓度（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2引起钙瞬变增加，而且随浓度升高而增加，统计学比较差异显著（P<0.01）分别为84.07±19.68，269.82±59.61，478.09±87.15。心肌细胞作为终末分化细胞，正常情况下不存在明显的凋亡。

2.2 细胞凋亡

H2O2各剂量组的细胞凋亡率和空白对照组展开比较，差异均具统计学意义（P<0.01）。在作用时间1、3 h下H2O2组均伴随H2O2浓度增大，豚鼠心肌细胞凋亡率随之增大；作用到6 h时，0.25 mmol/L剂量组细胞凋亡率达到最高值23.3%，该峰值后细胞凋亡率便随H2O2浓度增大而下降；作用12 h的H2O2组随H2O2浓度增大，细胞凋亡率随之增大，至0.25 mmol/L时凋亡率达18.9%的峰值，此后随H2O2浓度增大反下降。

心肌细胞属于终末分化细胞，在正常情况下是无明显凋亡的。不过疾病状态之下，比如心肌梗塞、缺血、缺氧及再灌注损伤，心肌细胞将产生显著凋亡；本结果证实低剂量（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2可明显强化心肌细胞钙离子浓度，同时还有着时间和剂量依赖性，从而可诱导产生心肌细胞的凋亡，进而对整个人体健康造成危害[14-15]。

H2O2对豚鼠心肌细胞凋亡率影响见表2。

表2 H2O2对豚鼠心肌细胞凋亡率影响Table 2 Flow cytometry analyses of cell apoptosis induced by H2O2

3 结论

1）Ca2+属于众多细胞凋亡信号载体，对于细胞生存和凋亡存在重要作用[16-18]，本试验通过激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞荧光值变化，代表钙离子浓度变化，发现0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2能明显增加心肌细胞的钙离子浓度，并且呈时间及剂量依赖性。

2）豚鼠心肌细胞在 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2影响下DNA凋亡率随着暴露剂量增加而增加。

本试验中的过氧化氢作为外源性活性氧，进入人体内后可作为信号，通过诱导线粒体的通透性转为变孔开放，推动线粒体的钙离子内流，同时令细胞自身线粒体和其它线粒体产生氧化应激反应。氧化应激反应是透过影响电压的依赖性钙离子通道从而令非特异性细胞膜钙离子通透性产生变动及产生钠钙离子交换等，进而影响钙离子（Ca2+）由内质网释放[19]，进而破坏内质网中Ca2+稳态，促发内质网出现超负荷反应[20]。由此可判定外源性过氧化氢透过心肌细胞抗氧化防御系统受损，造成内源性活性氧生成的增加，进而出现氧化应激，推动细胞内钙离子的重新分布，最终诱导心肌细胞凋亡。

本文利用细胞毒理学中的细胞形态学变化以及细胞凋亡检测技术，研究食品级过氧化氢的对豚鼠心肌细胞钙瞬变以及细胞凋亡的影响及其作用机制，为今后食品级过氧化氢检测及毒理学研究提供参考。

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Toxicological Studies on Food Grade Hydrogen Peroxide at Cell Level

DING Yu，YANG Lei，WANG Chen-guang，TIAN Kai，LIU Feng-juan，YU Yan-yan
（Technical Center for Safety of Industrial Products of Tianjin Enter-Exit Inspection Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China）

As one of the representative of strong oxidizing agent，hydrogen peroxide is widely used in the food industry.However，there is a serious harm to the health of consumers in the food residue and illegally added hydrogen peroxide.In recent years，as a hot subject，cellular toxicology has been used to study the law and mechanism of the damage of exogenous substances on living cells which has a good application prospect in the field of food safety detection and research.In this paper，the changes of cell morphology and cell apoptosis were used to study the harm of food grade hydrogen peroxide.

hydrogen peroxide；cell toxicology；food safety

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.038

丁宇（1980—），男（汉），高级工程师，研究生，研究方向：危险品检测。

2017-03-23