氨氮和亚硝酸盐对红螯螯虾幼虾和亚成虾的急性毒力

潘训彬，张秀霞，鲁耀鹏，郑佩华，王安利，冼健安∗

氨氮和亚硝酸盐对红螯螯虾幼虾和亚成虾的急性毒力

潘训彬1，张秀霞2，鲁耀鹏1，郑佩华1，王安利1，冼健安2∗

1华南师范大学生命科学学院，广东 广州510631；2中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101

【目的】近年来，红螯螯虾养殖面积越来越广泛，明确不同规格的红螯螯虾对氨氮和亚硝酸盐的耐受力，有利于提高其养成率，促进其养殖业的健康发展。【方法】在水温24～25℃、pH 7.9～8.0的条件下，研究了氨氮和亚硝酸盐对红螯螯虾幼虾和亚成虾的急性毒性，分析半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)。【结果】总氨氮对红螯螯虾幼虾的24、48、72和96 h LC50分别为 188.0、136.15、104.67 和 88.00 mg·L-1，SC 为 8.80 mg·L-1；总氨氮对亚成虾的 24、48、72 和 96 h LC50分别为344.01、270.46、205.15 和 167.68 mg·L-1，SC 为 16.77 mg·L-1；非离子氨对幼虾的 24、48、72 和 96 h LC50分别为 10.16、7.35、5.65和 4.75 mg·L-1，SC 为0.48 mg·L-1；非离子氨对亚成虾的 24、48、72 和96 h LC50分别为18.58、14.60、11.08 和 9.05 mg·L-1，SC为 0.91 mg·L-1；亚硝酸盐对幼虾的 24、48、72 和 96 h LC50分别为 46.76、33.88、27.97 和 22.81 mg·L-1，SC 为 2.28 mg·L-1；亚硝酸盐对亚成虾的 24、48、72 和 96 h LC50分别为 77.56、59.33、45.41 和 37.48 mg·L-1，SC 为 3.75 mg·L-1。 【结论】红螯螯虾对氨氮的耐受力高于亚硝酸盐，亚成虾对氨氮和亚硝酸盐的耐受力高于幼虾。

红螯螯虾；氨氮；亚硝酸盐；急性毒性

红螯螯虾Cherax quadricarinatus(von Martens)原产自澳大利亚，是目前世界上主要养殖的淡水经济虾类之一。红螯螯虾自20世纪90年代便已引入我国试养，由于虾苗繁殖量低及凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei Boone正处于养殖热潮，致使红螯螯虾没能大面积推广，仅有少量规模的养殖。近年来，凡纳滨对虾疾病频发、养成率低下，罗非鱼养殖也面临利润空间低等状况，这些主养品种一直处于低迷且难以短时恢复的状态。红螯螯虾具备食性广、个体大、生长速度快、适应性强、出肉率较高、肉质鲜美、经济价值高等优点(赵云龙等，2000)。近几年，借着克氏原螯虾Procambarus clarkii Girard的养殖势头，红螯螯虾的养殖规模也逐渐扩大。但是，红螯螯虾养殖方面的研究仍较少，主要集中在育苗技术方面的研究报道(罗文等，2004；吴志新等，2000；赵云龙等，2000)。氨氮和亚硝酸盐是水产集约化养殖过程中主要的2种水体毒性污染物(寇红岩等，2014；冼健安等，2014)，本文研究了氨氮和亚硝酸盐对2种规格的红螯螯虾的毒性，确定了半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)，以期为红螯螯虾的人工养殖提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用红螯螯虾购自海南省琼海市某私人养殖场，幼虾体长 25～38 mm，体重 0.83～1.88 g，亚成虾体长72～93 mm，体重38.31～54.92 g。实验前在实验室循环养殖系统养殖1周，水温24～25℃，pH 7.9～8.0，溶解氧5.6～6.0 mg·L-1。 实验前停食24 h，选取处于蜕皮间期、健康无病患、附肢完整的螯虾作为实验用虾。

1.2 实验方法

毒性实验参考罗静波等(2005)和钟君伟等(2013)的方法。实验在放置30 L水的塑料储物箱(52.5 cm×37.5 cm×32 cm)中进行。经预实验确定浓度范围后，再按等对数间距分别设置对照组和7个浓度梯度组，浓度设置如表1所示。以NH4Cl(广州化学试剂厂，分析纯)作为氨氮来源，NaNO2(广州化学试剂厂，分析纯)作为亚硝酸氮来源，根据设定的浓度准确称量并溶解到水中。幼虾组每箱放置幼虾20尾，亚成虾组放置10尾，每个浓度组设置3个重复。实验期间不投喂，及时取出死亡个体及排污，观察记录24、48、72和96 h的死亡个体数。为保证水体的实验浓度稳定，每24 h换水及投药一次。

表1 氨氮和亚硝酸盐氮的实验浓度Table 1 The experimental doses of ammonia-N and nitrite-N

1.3 数据处理

死亡率数据显示为平均值±标准差，应用SPSS 18.0进行单因素方差分析，采用Tukey多重比较分析组间差异性显著程度，P＜0.05为差异性显著。实验数据利用 SPSS 18.0的 Probit分析法计算LC50，其中响应频率(response frequency)为死亡个数，观测值汇总(total observed)为实验动物数(幼虾60尾、亚成虾30尾)，协变量(covariates)为相应的实验剂量，模型(model)设定为概率(probit)，转化(transform)设定为对数底为10(log base 10)。SC按以下公式计算(Sprague，1971):

2 结果与分析

2.1 氨氮对红螯螯虾的急性毒性效应

如表2、表3所示，对照组无死亡现象，在氨氮急性胁迫下，随着胁迫浓度增加和胁迫时间的延长，幼虾和亚成虾的死亡率均不断上升，氨氮毒性效应增强。幼虾组中，总氨氮浓度为50.00和67.45 mg·L-1时，分别在48和24 h后出现死亡现象，其他浓度组均在24 h内出现死亡；总氨氮浓度为165.58、223.36和301.30 mg·L-1时，分别在96、72和48 h内全部死亡。亚成虾组中，总氨氮浓度为100.00和134.90 mg·L-1时，分别在72和24 h后出现死亡现象，其他浓度组均在24 h内出现死亡；总氨氮浓度为331.13、446.68 和 602.56 mg·L-1时，分别在 96、72和72 h内全部死亡。

依据表2、表3的结果，计算氨氮的LC50和SC，结果如表4所示。总氨氮对红螯螯虾幼虾和亚成虾的24 h LC50分别为188.08和344.01 mg·L-1，SC分别为8.80和16.77 mg·L-1。非离子氨对红螯螯虾幼虾和亚成虾的24 h LC50分别为10.16和18.58 mg·L-1，SC分别为0.48和0.91 mg·L-1。

表2 氨氮对红螯螯虾幼虾的急性毒性Table 2 Acute toxicity of ammonia-N on juvenile C.quadricarinatus

表3 氨氮对红螯螯虾亚成虾的急性毒性Table 3 Acute toxicity of ammonia-N on subadult C.quadricarinatus

表4 氨氮对红螯螯虾的半致死浓度和安全浓度Table 4 The LC50s and SC of total ammonia-N and non-ionic ammonia to C.quadricarinatus

2.2 亚硝酸盐对红螯螯虾的急性毒性效应

如表5、表6所示，对照组无死亡现象，在亚硝酸盐急性胁迫下，随着胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长，幼虾和亚成虾的死亡率均不断上升，亚硝酸盐毒性效应增强。幼虾组中，亚硝酸氮浓度为10.00、13.49 和 18.20 mg·L-1时，分别在 72、48 和24 h后出现死亡现象，其他浓度组均在24 h内出现死亡；亚硝酸氮浓度为44.67和60.26 mg·L-1时，分别在72和48 h内全部死亡。亚成虾组中，亚硝酸氮浓度为20.00和26.98 mg·L-1时，分别在48和24 h后出现死亡现象，其他浓度组均在24 h内出现死亡；亚硝酸氮浓度为66.22、89.34和120.52 mg·L-1时，分别在96、72和48 h内全部死亡。

依据表5、表6的结果，计算亚硝酸氮的LC50和SC，结果如表7所示。亚硝酸氮对红螯螯虾幼虾和亚成虾的24 h LC50分别为46.76和77.56 mg·L-1，SC分别为2.28和3.75 mg·L-1。

表5 亚硝酸氮对红螯螯虾幼虾的急性毒性Table 5 Acute toxicity of nitrite-N on juvenile C.quadricarinatus

表6 亚硝酸氮对红螯螯虾亚成虾的急性毒性Table 6 Acute toxicity of nitrite-N on subadult C.quadricarinatus

表7 亚硝酸氮对红螯螯虾的半致死浓度和安全浓度Table 7 The LC50s and SC of nitrite-N to C.quadricarinatus

3 讨论

3.1 氨氮对虾类的急性毒性

氨氮是水生动物含氮废物的主要排泄形式，对于甲壳动物，因物种而异，其含氮废物有40%～90%以氨氮的形式从鳃上皮组织排出。此外，微生物对残饵和粪便中的含氮有机物进行氨化作用所产生的氨氮，也是养殖水体中氨氮的主要来源(冼健安等，2014)。因此，在集约化养殖系统中，氨氮往往随着养殖时间的延长而不断积累，成为养殖环境中主要的胁迫因子之一。研究表明，氨氮具有较强的毒性，可对虾类的生长、变态、组织结构、生理代谢、免疫力和抗病力等产生负面作用。

多种虾类的氨氮LC50和SC已有报道，如凡纳滨对虾(孙国铭等，2002)、南方滨对虾Litopenaeus schmitti Burkenroad(Barbieri，2010)、 斑 节 对 虾Penaeus monodon Fabrieiu(胡贤德等，2009)、罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii De Man(王龙等，2011)、克氏原螯虾(罗静波等，2006；钟军伟等，2013)等。 本研究中，水温 24～25℃、pH 7.9～8.0、溶解氧5.6～6.0 mg·L-1的条件下，氨氮对体长25～38 mm、体重0.83～1.88 g的红螯螯虾幼虾的48 h LC50为136.15 mg·L-1，与陈孝煊等(1995)的研究结果相似。氨氮对体长25～38 mm和72～93 mm的红螯螯虾的24 h LC50分别为188.08和344.01 mg·L-1。虽然各研究所选用的虾大小规格有一定的差异，但经粗略比较，克氏原螯虾的氨氮耐受力要强于红螯螯虾。就规格大小而言，红螯螯虾亚成虾的氨氮耐受能力远高于幼虾，与克氏原螯虾相似(钟君伟等，2013)，规格越大，氨氮耐受力越强。

对于海水虾类品种，已测定出氨氮对凡纳滨对虾(孙国铭等，2002)、南方滨对虾(Barbieri，2010)、斑节对虾(胡贤德等，2009)、短沟对虾(Kir et al.，2004)、脊尾白虾(梁俊平等，2012)的 24 h LC50。水体盐度是氨氮毒性的重要影响因素，较高的盐度会降低非离子氨(NH3)的比例。另外，Na＋很容易置换鳃膜上的离子氨(NH4＋)，Ca2＋和其他二价阳离子也通过增强鳃膜渗透性或增加Na＋的富集来减少氨的毒性，即盐度越高，虾类的氨氮耐受性越强(冼健安等，2014)。上述虾类均为海水品种，它们在较高盐度水体中的LC50也明显低于2种淡水螯虾，表明螯虾总科的虾类可能相对其他科的虾类具有更强的氨氮耐受力，这可能是螯虾能够在恶劣水质环境中生存的重要原因之一。

氨氮由离子氨和非离子氨2种形式组成，由于非离子氨不带电荷，容易透过细胞膜进入虾体内，所以氨氮的毒性主要集中在非离子氨上，而非离子氨所占的比例又与水体温度、pH及盐度有关(冼健安等，2014)。因此，分析特定环境条件下的非离子氨毒性可能更具参考价值。针对本研究实验水体的环境条件，换算得到非离子氨对红螯螯虾幼虾和亚成虾的24 h LC50分别为10.16和18.58 mg·L-1，结果与克氏原螯虾(钟君伟等，2013)较接近，红螯螯虾的非离子氨耐受性也高于其他虾类(梁俊平等，2012； 孙国铭等，2002； Barbieri，2010； Kir et al.，2004)。

3.2 亚硝酸盐对虾类的急性毒性

亚硝酸盐是养殖水体中另一种常见的含氮毒性污染物，主要由氨经过亚硝化细菌的转化而来。因此，在集约化养殖过程中，随着养殖时间的延长，氨氮逐渐积累，亚硝酸盐的浓度也会越来越高。亚硝酸盐对虾类也产生各种毒性影响，如抑制生长和变态发育(彭自然等，2004；Mallasen＆ Valenti，2006)、破坏组织结构(胡义波等，2005)、降低血淋巴载氧能力(Cheng＆Chen，1999)、扰乱氮的生理代谢(Lee＆Chen，2004)、抑制免疫力和抗病力(黄翔鹄等，2006；冼健安等，2016；Chand＆ Sahoo，2006； Xian et al.，2011)等。 因此，亚硝酸盐也是养殖者重点监测的指标之一。

亚硝酸盐对多种虾类的LC50已有较多的报道，如克氏原螯虾(罗静波等，2005；於叶兵等，2011)、罗氏沼虾(Chen＆Lee，1997)、日本沼虾M.nipponense(Wang et al.，2004)和马氏沼虾 M.malcolmsonii(Chand＆Sahoo，2006)。本研究中，亚硝酸氮对红螯螯虾幼虾和亚成虾的24 h LC50分别为46.76和77.56 mg·L-1，略高于其他淡水虾类。就规格大小而言，红螯螯虾亚成虾的亚硝酸盐耐受能力远高于幼虾，规格越大，亚硝酸盐耐受力越强。

对于海水虾类品种，亚硝酸氮对凡纳滨对虾(Lin ＆ Chen，2003)、斑 节 对 虾(Chen et al.，1990a)、中国明对虾Fenneropenaeus chinensis(Chen et al.，1990b)和长毛对虾 P.penicillatus(Chen＆Lin，1991)的24 h LC50已测得。红螯螯虾的亚硝酸盐耐受性明显低于这些海水种类，这是由于盐度对亚硝酸盐的毒性影响很大，盐度越高，虾类的亚硝酸盐耐受力越高。盐度影响亚硝酸盐毒性主要与Cl-的含量有关，Cl-可与NO2-竞争鳃上的吸收位点，盐度越高，Cl-含量越高，被吸收进入体内的N就越少，毒性效应越低(寇红岩等，2014)。

综上所述，红螯螯虾对氨氮的耐受力高于亚硝酸盐，其规格越大，氨氮和亚硝酸盐耐受力也越强。相对其他虾类，红螯螯虾的氨氮耐受力较强，亚硝酸盐耐受力强于其他淡水虾类，而弱于海水虾类。红螯螯虾幼虾的氨氮和亚硝酸盐的SC分别为8.80和2.28 mg·L-1，亚成虾的氨氮和亚硝酸盐的SC分别为16.77和3.75 mg·L-1，SC相对较高，实际养殖状态下远低于SC，但在养殖过程中也应尽量控制氨氮和亚硝酸盐的含量，以防慢性胁迫带来的不良影响。此外，2～3 cm的幼虾是目前放塘的常用规格，幼虾的耐受力相对较弱，在养殖前期应注意加强水质调控、稳定水质，以免环境因子的剧烈变化而导致的胁迫毒害作用。

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Acute toxicity of ammonia and nitrite on juvenile and subadult redclaw crayfish(Cherax quadricarinatus)

PAN Xunbin1， ZHANG Xiuxia2， LU Yaopeng1， ZHENG Peihua1， WANG Anli1， XIAN Jian′an2∗

1College of Life Science， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510631， China；2Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

【Aim】 In recent years，the aquaculture of redclaw crayfish has significantly increased.The aim of this study is to understand the ammonia-N and nitrite-N tolerance of different life stages of red claw crayfish to improve the survival rate and promote the redclaw crayfish production in aquaculture.【Method】 The acute toxicity of ammonia-N and nitrite-N on juvenile and subadult redclaw crayfish was tested，and the half lethal concentrations(LC50)and safe concentrations(SC)under 24～25℃ and pH 7.9～8.0 were determined.【Result】 The LC50s of total ammonia-N for juvenile crayfish at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 188.0， 136.15，104.67 and 88.00 mg·L-1， and the SC was 8.80 mg·L-1.The LC50s of total ammonia-N for subadult at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 344.01， 270.46， 205.15 and 167.68 mg·L-1， and the SC was 16.77 mg·L-1.The LC50s of non-ionic ammonia for juvenile at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 10.16， 7.35， 5.65 and 4.75 mg·L-1， and the SCwas 0.48 mg·L-1.The LC50s of nonionic ammonia for subadult at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 18.58， 14.60， 11.08 and 9.05 mg·L-1， and the SCwas 0.91 mg·L-1.The LC50s of nitrite-N for juvenile at 24 h， 48 h， 72 h and 96 h were 46.76， 33.88， 27.97 and 22.81 mg·L-1， and the SC was 2.28 mg·L-1.The LC50s of nitrite-Nfor subadult at 24 h，48 h，72 h and 96 h were 77.56，59.33，45.41 and 37.48 mg·L-1，and the SC was 3.75 mg·L-1.【Conclusion】 The tolerance of redclaw crayfish to ammonia-N was stronger than nitrite-N， and the tolerance of subadult to ammonia-N and nitrite-N was stronger than that of juvenile.

Cherax quadricarinatus； ammonia； nitrite； acute toxicity

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.011

2017-03-31 接受日期(Accepted):2017-05-17

海南省重点研发计划项目(ZDYF2016084)；中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630052016011、1630052016021)

潘训彬，男，实验师。研究方向:水产养殖生态及毒理学，水产动物营养与饲料学。E-mail:defun＠126.com

∗通信作者(Author for correspondence)，E-mail:xian-ja＠163.com

(责任编辑:郭莹)