烟草花粉离体萌发液体培养基的筛选和优化

， ， (.玉溪中烟种子有限责任公司， 云南 玉溪 65300； .云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪 65300)

烟草花粉离体萌发液体培养基的筛选和优化

牛永志1，索文龙1，马文广2
(1.玉溪中烟种子有限责任公司， 云南 玉溪 653100； 2.云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪 653100)

以云烟97和红花大金元花粉为试验材料，研究了液体培养基配方、花粉浓度对花粉离体萌发的影响。结果表明，浓度配比10%～15%蔗糖、25 mg/L硼酸的液体培养基为最佳培养基；培养基中的花粉浓度以2.5 g/L为宜。

花粉； 萌发； 培养基

烟草是我国的重要经济作物，目前我国烟叶生产上普遍种植雄性不育系和杂交品种，在繁殖雄性不育系和杂交种种子时，通常需要提前采集父本花粉，经过一段时间贮藏，待母本开花后，父本纯花粉与花粉介质按一定比例配制成介质花粉进行授粉。为保证种子的产量和质量，经过贮藏的花粉在使用之前，需要做花粉活力检测，以检验花粉活力。花粉活力检测方法主要分3类： 1) 染色法，如氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘钾(I-KI)染色法等； 2) 花粉离体萌发测定法； 3) 花粉授粉结实检测法。目前使用较多的鉴定方法有TTC染色法和花粉离体萌发测定法。染色法由于能使未成熟和衰老的花粉着色，而这些花粉不一定具有受精能力，致使花粉活性测定值偏高，花粉授粉结实检测法是根据结实情况判断花粉活性，结果比较准确，但由于授粉到每个柱头的花粉量较多，无法定量判断花粉的活力。李宗平等[1]和孙光玲等[2]报道，花粉离体培养萌发测定花粉活力是较为理想的烟草花粉活力鉴定方法。烟草花粉离体萌发测定法，普遍采用将花粉播种到固体培养基上培养一段时间后观察花粉萌发情况，经常会遇到花粉重叠聚集，花粉粒计数及活力统计困难，在番茄、唐菖蒲、百合等花粉萌发测定使用液体培养基取得良好的效果[3-5]，而在烟草花粉活力萌发测定时使用液体培养基的研究尚未见系统的研究报道。本研究通过对液体培养基进行筛选和优化，以期找到一种花粉分散性好、准确可靠、简便易行的烟草花粉活力检测方法，从而为烟草杂交制种中花粉采集、贮藏、授粉提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为云烟97和红花大金元花粉，试剂为蔗糖、硼酸、无水氯化钙。

1.2 方 法

1.2.1 花粉收集

采集含蕾至花始开期的云烟97和红花大金元花药，自然晾干至花药裂开，筛出花粉，自然晾晒至花粉含水量为6.0%，花粉密封置于4 ℃下贮藏备用。

1.2.2 液体培养基组分筛选

以10%的蔗糖作为花粉萌发基本液体培养基，加入硼酸、氯化钙配制成不同组分的液体培养基，设计了11个液体培养基处理(见表1)。

表1 液体培养基组分

处理培养基组分T1水T210%蔗糖T310%蔗糖+25mg/L硼酸T410%蔗糖+50mg/L硼酸T510%蔗糖+100mg/L硼酸T610%蔗糖+25mg/L硼酸+10mg/L氯化钙T710%蔗糖+50mg/L硼酸+10mg/L氯化钙T810%蔗糖+100mg/L硼酸+10mg/L氯化钙T910%蔗糖+25mg/L硼酸+20mg/L氯化钙T1010%蔗糖+50mg/L硼酸+20mg/L氯化钙T1110%蔗糖+100mg/L硼酸+20mg/L氯化钙

称取2.5 mg纯花粉于2.5 mL离心管内，分别加入不同组分的液体培养基，混合均匀后，滴入凹形载玻片凹形槽内，然后将载玻片置于加2层湿润滤纸的培养皿中，然后将培养皿置于恒温恒湿培养箱中，25 ℃恒温暗培养3 h后，将含有花粉的液体培养基混合均匀后于10×物镜下进行镜检，以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准，每个处理均设3次重复(制3个片)，每重复随机观察3个视野，统计花粉萌发率。花粉萌发率(%)=萌发花粉粒数/观察的总花粉粒数×100%。

1.2.3 蔗糖浓度筛选

根据液体培养基组分筛选结果设置蔗糖浓度分别为10%、15%、20%、25%和30%，称取2.5 mg纯花粉于2.5 mL离心管内，分别加入不同蔗糖浓度的液体培养基，混合均匀后，滴入凹形载玻片凹形槽内，25 ℃恒温暗培养3 h后进行镜检，10×物镜下统计花粉萌发率。

1.2.4 花粉浓度筛选

分别称取1，2.5，5，10，20 mg纯花粉于2.5 mL离心管内，离心管内加入1 mL根据结果筛选出较为理想的液体培养基，混合均匀后，滴入凹形载玻片凹形槽内，25 ℃恒温暗培养3 h后进行镜检，10×物镜下统计视野内花粉粒数和花粉萌发率。

图1 不同培养基组分对云烟97花粉萌发率的影响

2 结果与分析

2.1 不同培养基组分对云烟97和红花大金元花粉萌发的影响

不同培养基组分对云烟97花粉萌发率的影响见图1。由图1可知，处理T 3花粉萌发率最高，为46.98%，处理T 7和T 5其次，花粉萌发率分别为42.10%和41.07%，处理T 9最低，为1.95%。图2 A～图2 C分别为花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸(T 3)、10%蔗糖+50 mg/L硼酸+10 mg/L氯化钙(T 7)和10%蔗糖+100 mg/L硼酸(T 5)的培养基上花粉粒萌发情况。

不同培养基组分对红花大金元花粉萌发率的影响规律与云烟97相似。由图3可知，处理T 3花粉萌发率最高，为61.76%，处理T 7和T 5其次，花粉萌发率分别为54.43%和54.07%，处理T 9最低，为2.58%。

2.2 不同蔗糖浓度对云烟97和红花大金元花粉萌发的影响

根据液体培养基组分初步筛选结果表明，云烟97和红花大金元花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基上花粉萌发率最高，为进一步优化液体培养基，设置了5个蔗糖浓度，硼酸浓度均为25 mg/L，不同蔗糖浓度液体培养基对云烟97和红花大金元花粉萌发的影响见表2。由表2可知，对于云烟97，花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸和15%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基上花粉萌发率最高，分别为41.78%和42.14%，之后随着蔗糖浓度的升高，花粉萌发率急剧下降，花粉在含有30%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基上萌发率仅为0.87%；对于红花大金元，花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸和15%蔗糖+25 mg/L硼酸液体培养基上花粉萌发率最高，分别为56.54%和57.06%，之后随着蔗糖浓度的升高，花粉萌发率急剧下降，花粉在含有30%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基上萌发率仅为1.21%。

图2 T 3、T 7和T 5处理对云烟97花粉萌发率的影响

表2 蔗糖浓度对花粉萌发率的影响

硼酸浓度(mg/L)蔗糖浓度(%)云烟97花粉萌发率(%)红花大金元花粉萌发率(%)1041．7856．541542．1457．06252013．1517．12257．089．76300．871．21

2.3 不同花粉浓度对云烟97和红花大金元花粉萌发的影响

花粉萌发采用含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基，培养基中花粉浓度对花粉萌发的影响见表3。由表3可知，花粉浓度为1 g/L时，视野内花粉数平均为87个，云烟97和红花大金元花粉萌发率分别为24.26%和27.96%；花粉浓度为2.5 g/L时，视野内花粉数平均为203个，云烟97和红花大金元花粉萌发率分别为40.39%和54.35%；当花粉浓度为5 g/L时，视野内花粉粒数平均为418个，花粉管出现缠绕重叠，难以统计花粉萌发率；当花粉浓度为10 g/L和20 g/L时，视野内花粉粒和花粉管出现重叠，难以统计花粉萌发率。图4为液体培养基中不同花粉浓度下视野内红花大金元花粉粒数和花粉萌发情况，从图4 C～图4 E可以看出，当花粉浓度≥5 g/L，视野内花粉粒会叠加，花粉管缠绕重叠，花粉粒数和花粉萌发率难以统计。

图3 不同培养基组分对红花大金元花粉萌发率的影响

表3 花粉浓度对花粉萌发的影响

花粉浓度(g/L)视野内花粉数云烟97花粉萌发率(%)红花大金元花粉萌发率(%)18724．2627．962．520340．3954．355418——10———20———

注：“—”表示无法统计。

3 结论与讨论

1) 对于云烟97和红花大金元，花粉在含有10%～15%蔗糖+25 mg/L硼酸的液体培养基上花粉萌发率高，适宜作为云烟97和红花大金元花粉活力检测的培养基。

2) 对于云烟97和红花大金元，使用液体培养基检测花粉活力，培养基中的花粉浓度以2.5 g/L为宜。

培养基组分、pH值和培养条件影响花粉离体萌发[6-8]。培养基组分中的蔗糖、硼酸、外源钙、植物生长调节剂等在适宜浓度范围内能促进花粉的萌发和花粉管的生长，过高抑制花粉萌发和花粉管生长。本研究结果表明，对于云烟97和红花大金元，花粉离体萌发适宜的液体培养基组分为10%～15%蔗糖+25 mg/L硼酸，蔗糖和硼酸浓度过高，花粉萌发率下降；同时本研究发现，如外源Ca2+不是云烟97和红花大金元花粉离体萌发所必需的，可能与细胞内游离Ca2+的含量有关。有研究结果表明，花粉萌发和花粉管生长对培养基中糖类的浓度具有严格的要求，当外界糖浓度低于花粉内部的渗透压时，花粉壁破裂，内容物析出，导致花粉失去生活力，而蔗糖浓度高时，又会造成花粉的质壁分离而抑制萌发[9-10]，与本研究结果基本一致，但本研究未对花粉壁破裂和花粉的质壁分离现象进行观察。

图4 不同花粉浓度下红花大金元花粉萌发情况

本研究只对2个烤烟品种花粉离体萌发液体培养基中的蔗糖、硼酸、外源Ca2+及花粉浓度进行了初步的筛选和优化，有待对烤烟其它品种、白肋烟、香料烟等花粉离体萌发液体培养基、培养基pH值和培养条件进行筛选和优化，同时对影响花粉萌发和花粉管生长的因素进行系统深入的研究，从而建立一套成熟的、系统的烟草花粉离体活力检测技术体系。

[1]李宗平,张俊杰,彭灏,等.烟草花粉活力鉴定方法筛选[J].中国烟草科学,2013,34(4):80-82.

[2]孙光玲,王银生,胡乾政.烟草花粉储藏与活力测定[J].中国烟草,1994,15(1):24-26.

[3]王富,李文丽,秦公伟,等.番茄花粉萌发液体培养基的筛选和组分优化[J].北方园艺,2008(11):143-145.

[4]黄蓓丽,耿兴敏,胡凤荣,等.唐菖蒲花粉离体萌发的液体培养基研究[J].安徽农业大学学报,2009,36(4):593-597.

[5]年玉欣,罗凤霞,张颖,等.测定百合花粉生命力的液体培养基研究[J].园艺学报,2005,32(5):922-925.

[6]刘雪莲,陈莹.培养基组分对花粉离体萌发的影响研究进展[J].通化师范学院学报,2009,30(12):43-46.

[7]张绍铃,陈迪新,康琅,等.培养基组分及pH值对梨花粉萌发和花粉管生长的影响[J].西北植物学报,2005,25(2):225-230.

[8]龚双姣,马陶武,刘强.培养基组分及培养条件对蜡梅花粉萌发及花粉管生长的影响[J].西北植物学报,2012,32(6):1 254-1 260.

[9]田翠婷,吕洪飞,王锋,等.培养基组分对离体花粉萌发和花粉管生长的影响[J].北京林业大学学报,2005,25(2):225-230.

[10]周怀军,安连荣,朱哲锋.杏树不同品种及果枝花粉发芽试验研究[J].河北林果研究,2000,15(3):253-256.

Screening and Optimization of Liquid Culture Medium for Pollen Germination in Vitro

NIUYongzhi1,SUOWenlong1,MAWenguang2

2016-12-25

中国烟草总公司(110201302006)；云南省烟草公司 (2013 YN 10) 资助项目。

牛永志(1980—)，男，河南周口人；硕士，主要从事烟草种子科学方面研究；E-mail：niuyonzhi@qq.com。

马文广(1972—)，男，云南玉溪人；研究员，主要从事烟草品种选育及种子科学方面研究；E-mail：mwg@tobacco-seed.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.05.078

S 527

A

1001-4705(2017)05-0078-04