脱水对万寿竹种子发芽及部分抗逆生理指标的影响

2017-12-02 02:58贵州大学农学院贵阳550025贵州大学中药材研究所贵阳550025
种子 2017年5期
关键词:浸出液过氧化物电导率

, , , , ,, , , , (.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.贵州大学中药材研究所, 贵阳 550025)

脱水对万寿竹种子发芽及部分抗逆生理指标的影响

朱力1,2,王华磊1,2,赵致1,2,刘红昌1,2,罗春丽1,2,李金玲1,2,罗夫来1,2,黄明进1,2,汪芹1,方月萍1
(1.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.贵州大学中药材研究所, 贵阳 550025)

[目的]探究万寿竹种子脱水过程中,发芽及部分抗逆生理指标的变化情况,为万寿竹种子贮藏及采收提供理论依据。[方法]利用室温硅胶干燥法获得45.90%、40.50%、38.07%、33.08%、27.26%、16.67%、14.63% 7个含水量梯度的种子,以未干燥的种子(49.12%)为空白对照,分别测定各个含水量梯度种子的生活力、发芽率、电导率、CAT、SOD、POD、AsA-POD活性、MDA、可溶性蛋白质含量。[结果]种子含水量保持在33.08%以上时,能保持较高的生活力、发芽率,当含水量下降到33.08%以下时,种子发芽率和生活力开始显著下降。[结论]万寿竹种子不耐脱水,属于顽拗性种子,贮藏时含水量应保持在33.08%以上。

顽拗性种子; 抗氧化酶; 发芽率; 生活力

万寿竹[Disporumcantoniense(Lour.) Merr].为百合科(Liliaceae),万寿竹属(Disporum)多年生草本植物,其根及根茎入药,称百尾参[17]。其味甘、淡、性平,具有润肺止咳、健脾消积的功效,可用于虚损咳喘、痰中带血、肠风下血、食积胀满等症状[4]。百尾参是贵州省安顺市的野生名贵药材和民族药。随着制药企业对百尾参需求量的增加,野生资源已经远远不能满足市场需求,这就急需万寿竹野生变家种栽培技术的研究和良种生产技术体系的建立。目前,对万寿竹的研究较少,主要集中在药理作用,生长习性等方面[5-6,13-15]。对于万寿竹的种子生产技术研究较少,黄楠等研究了万寿竹种子的萌发特性,发现万寿竹种子千粒重为33.24 g;种子吸水在30 h达到了饱和状态,吸水量为96.90%;万寿竹种子的最适萌发条件为:种子不去皮,用萌发处理剂浸泡24 h,在25 ℃黑暗条件下进行纸间培养[8]。黄楠等[8]通过进一步的实验,初步制定了万寿竹的种子质量标准,以净度为92.00%、发芽率为65.00%、千粒重为32.50 g、含水量为14.00%作为万寿竹种子的最优等级。对于万寿竹种子的采收,贮藏技术,脱水特性及种子生理生化特性,尚无人进行研究。因此,笔者研究了万寿竹种子在脱水过程中的生理生化变化,以明确万寿竹种子的生理特性,为合理贮藏提供理论依据,指导实际生产。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用万寿竹[Disporumcantoniense(Lour.) Merr.]种子采自贵州省安顺市紫云县百灵中药材基地,2014年11月22日采收多年生万寿竹果实,将果实去皮、除杂后得到新鲜种子,立即进行试验。试验所用种子经贵州大学农学院王华磊教授鉴定为百合科万寿竹属万寿竹种子。

万寿竹新鲜种子初始含水量为49.12%,百粒重为6.78 g,生活力为100%。

1.2 实验设备

真空硅胶干燥器、紫外分光光度计(普析通用)、酶标仪(Thermo Multiskan FC)、Cond 3310手持式电导率分析仪、培养皿、德国Retsch MM 400球磨仪、光照培养箱、数显恒温水浴锅。

1.3 实验试剂

L-甲硫氨酸、硫代巴比妥酸、核黄素、30% H2O2、愈创木酚、三氯乙酸、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、TTC、乙二胺四乙酸二钠、重蒸酚、浓硫酸、考马斯亮蓝G-250、标准牛血清蛋白、蔗糖,实验用水均为去离子水。

1.4 种子脱水处理

将采收后新鲜果实去皮、漂洗,筛选出净种子,用尼龙网袋装好,埋在硅胶干燥器中,室温下脱水干燥,每天更换硅胶(经120 ℃充分干燥冷却后的),每隔24 h称重,获取不同含水量梯度(49.12%、45.90%、40.50%、38.07%、33.08%、27.26%、16.67%、14.63%)的万寿竹种子。

1.5 方 法

1.5.1 含水量测定

万寿竹种子初始含水量测定根据《农作物种子检验规程GB/T 3543.6-1995》,重复3次。

利用称重法计算从硅胶中取出不同批次万寿竹种子的含水量。种子的初始含水量记为A%,埋入干燥硅胶中种子的总重量记为M1。每次取出种子称取重量记为M2。利用公式计算出种子含水量,并依次得到不同含水量梯度的种子。

含水量=M2-[M1×(1-A%)]/M2。

1.5.2 发芽率测定

发芽率测定采用双层滤纸培养皿法,每个处理做4次重复,每培养皿放30粒种子。将万寿竹种子先用酒精消毒30 s,0.1% HgCl2消毒15 min,用无菌水反复冲洗后放入本实验室发明的百尾参种子萌发处理剂中浸泡24 h,放入铺有2层滤纸的培养皿中。发芽条件为25 ℃,黑暗,发芽周期为60 d,每天记录种子的发芽情况。

1.5.3 生活力测定

生活力测定采用TTC染色法。

1.5.4 电导率测定

实验使用的去离子水在使用前先在20 ℃条件下放置24 h以上,每个处理做3次重复。取50粒种子,称重,精确至0.01 g,将种子用去离子水反复冲洗后放入烧杯中,加入250 mL去离子水,封口,在20 ℃条件下放置24 h后,以去离子水做对照,测定种子浸出液电导率。100 ℃水浴煮沸30 min,冷却,用清洁丝网沥去种子,测定煮沸后种子浸出液的电导率,计算相对电导率。

1.5.5 抗氧化酶活性测定

参照高俊凤[7]《植物生理学实验指导》,有改动。种子从硅胶中取出后,先用液氮速冻,再用Retsch MM 400球磨仪在低温条件下打成粉,称取材料0.50 g,加入5 mL磷酸钠缓冲液(50 mmol/L,pH=7.0,内含1% pvp,1 mmol/L EDTA-Na2)研磨,4 ℃下15 000 r/min离心15 min,上清液定容至5 mL,取部分上清液经适当稀释后用于各抗氧化酶(CAT、POD、SOD、AsA-POD)活性,可溶性蛋白质含量和MDA含量的测定,每个处理3次重复。

1.6 数据统计分析方法

数据使用SPSS 19.0软件处理。图表制作使用Excel 2003处理。

2 结果与分析

2.1 脱水对万寿竹种子发芽率和生活力的影响

由表1可以看出,随着种子含水量的降低,万寿竹种子的发芽率整体呈下降的趋势,种子含水量从49.12%下降到33.08%的过程中,种子发芽率变化不明显,当种子含水量从33.08%继续下降时,种子发芽率开始显著下降,含水量从33.08%降至27.26%时,发芽率降到65.63%,下降了19.92%,种子含水量下降到16.67%时,发芽率降到53.13%,种子含水量从49.12%下降到16.67%,发芽率下降了39.97%,当种子含水量降至14.63%时,虽然生活力为58.37%,但种子已经不能发芽。种子含水量为49.12%(即初始含水量)和45.90%时,种子发芽率最高,达到88.51%,种子含水量在49.12%、45.90%、33.08%时,发芽率显著高于其他含水量梯度,种子含水量在40.50%,38.07%时,虽发芽率显著低于前三者,但发芽率仍保持在73.89%以上,显著高于种子含水量低于27.26%的处理。

表1 脱水处理对万寿竹种子发芽率和生活力的影响

种子含水量(%)发芽率(%)生活力(%)49.12 88.51±2.53a 100.00±0.00a45.90 88.51±2.53a 98.00±2.83a40.50 78.49±6.51bc 100.00±0.00a38.07 73.89±3.47c 97.00±1.41a33.08 81.96±4.63ab 97.00±1.41a27.26 65.63±3.13d 86.20±0.34b16.67 53.13±6.25e 76.60±0.46c14.63 0.00±0.00f 58.37±6.19d

注:同列中不同小写字母代表差异显著(plt;0.05)。下同。

由表1还可以看出,随着种子含水量的降低,万寿竹种子的生活力整体上呈下降趋势,种子含水量从初始含水量49.12%下降到33.08%的过程中,种子生活力变化不显著,均保持较高的生活力,在97.00%以上。当种子含水量降低到33.08%以下时,种子生活力开始显著下降,在种子含水量为14.63%时,种子生活力为58.37%,较初始含水量的种子生活力降低了41.63%,显著低于其它含水量梯度种子的生活力,表现出明显的顽拗性种子特性。

2.2 脱水对万寿竹种子浸出液电导率和相对电导率的影响

由表2可知,种子含水量为49.12%、45.90%、40.50%、38.07%,33.08%的浸出液电导率之间差异均不显著,变化范围在0.91~1.32μS/(cm·g)之间,而种子含水量为27.26%,16.67%,14.63%时,电导率均高于2.3μS/(cm·g);随着万寿竹种子的含水量下降,相对电导率呈上升趋势,种子初始含水量49.12%的相对电导率最低,仅为3.30%,种子含水量为16.67%时,相对电导率最高,达到38.99%,显著高于其他含水量梯度种子的相对电导率。

表2 脱水处理对万寿竹种子浸出液电导率和相对电导率的影响

种子含水量(%)浸出液电导率(μS/(cm·g)相对电导率(%)49.12 1.28±0.08b 3.30±0.20d45.90 1.24±0.02b 7.13±0.30d40.50 0.91±0.08b 14.10±1.69cd38.07 1.03±0.83b 18.30±12.63c33.08 1.32±0.19b 23.62±1.79bc27.26 2.38±0.37a 31.21±2.09ab16.67 2.33±0.30a 38.99±2.16a14.63 2.64±0.54a 32.99±2.18ab

2.3 脱水对万寿竹种子抗氧化酶活性的影响

2.3.1 脱水对万寿竹种子过氧化物酶活性的影响

由表3可知,万寿竹种子过氧化物酶活性随着种子含水量的下降呈先上升的趋势,种子含水量从49.12%降至38.07%,过氧化物酶活性显著升高。种子含水量为27.26%时,过氧化物酶活性达到峰值223.20 U/(g·min)(FW),显著高于其它种子含水量梯度的过氧化物酶活性,当种子含水量下降至16.67%时,过氧化物酶活性又迅速下降到93.22 U/(g·min)(FW),随着种子含水量继续下降,过氧化物酶活性变化不显著。

2.3.2 脱水对万寿竹种子过氧化氢酶活性的影响

由表3可知,过氧化氢酶活性随着万寿竹种子含水量的降低,总体上呈上升的趋势,初始含水量种子的过氧化氢酶活性最低,为178.72 U/(g·min)(FW),种子含水量为14.63%时,过氧化氢酶活性最高,达到352.50 U/(g·min)(FW),较初始含水量升高了97.23%。含水量从49.12%降至33.08%的过程中,种子内过氧化氢酶活性变化不显著,含水量低于27.26%时,种子内过氧化氢酶活性显著高于种子含水量高于38.07%的处理。

2.3.3 脱水对万寿竹种子超氧化物歧化酶活性的影响

由表3可知,初始含水量的SOD活性显著高于其它含水量梯度种子的SOD活性,种子含水量为16.67%时,SOD活性达到最低,并显著低于其它含水量梯度种子的SOD活性。种子含水量从初始含水量下降至45.90%时,SOD活性显著下降至349.62 U/g(FW),下降了9.59%,种子含水量从45.90%下降至38.07%的过程中,SOD活性无显著变化,种子含水量从27.26%降至16.67%的过程中,SOD活性显著降低,达到最低值,超氧化物歧化酶在种子脱水过程中的活性均低于初始含水量的种子。

表3 脱水处理对万寿竹种子抗氧化酶活性的影响

种子含水量(%)过氧化物酶活性[U/(g·min)(FW)]过氧化氢酶活性[U/(g·min)(FW)]超氧化物歧化酶活性(U/g)(FW)抗坏血酸过氧化物酶活性[μmol/(g·min)(FW)]49.12 69.63±6.63e 178.72±12.54c 386.73±3.49a 459.39±6.26e45.90 122±12.81bc 211.11±1.52c 349.62±0.76bc 578.38±3.31d40.50 142.3±2.45b 232.51±2bc 351.24±0.2bc 604.24±31.59d38.07 74.9±12.68e 188.6±2.66c 341.45±1.57cd 613.46±20.48d33.08 82.22±0.59de 277.56±16.55abc 361.2±2.6b 745.93±22.03c27.26 223.21±32.82a 323.97±32.26ab 357.04±3.14bc 641.97±28.95d16.67 93.22±0.34cde 316.55±8.24ab 324.65±20.22d 859.97±36.08b14.63 107.07±5.02cd 352.5±18.77a 356.52±8.83bc 1070.7±50.2a

2.3.4 脱水对万寿竹种子抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

由表3可知,抗坏血酸过氧化物酶活性随着万寿竹种子含水量的下降,总体上呈上升趋势,但在种子含水量从33.08%下降到27.26%的过程中出现显著的下降。在种子含水量下降初期,AsA-POD活性缓慢上升,初始含水量种子的AsA-POD活性最低,显著低于其它含水量梯度种子的AsA-POD活性。种子含水量由45.90%降至38.07%的过程中,AsA-POD活性变化不显著,降低至33.08%时,有了显著的提高,较初始含水量种子的AsA-POD活性提高了62.38%。种子含水量从27.26%继续下降的过程中,AsA-POD活性开始显著升高,种子含水量为14.63%的AsA-POD活性较种子含水量27.26%的AsA-POD活性提高了66.78%。

2.4 脱水对万寿竹种子丙二醛与可溶性蛋白质含量的影响

由表4可知,万寿竹种子在脱水过程中,丙二醛含量变化不显著。初始含水量的万寿竹种子丙二醛含量最高,这可能是万寿竹种子在自然成熟过程中,经历自然脱水时所积累的,种子含水量下降到45.90%的过程中,丙二醛含量迅速下降,下降了62.30%,随着种子含水量从45.90%继续下降,丙二醛含量逐渐上升,整体上呈上升趋势。丙二醛含量在万寿竹种子含水量为49.12%和33.08%时最高,在种子含水量为45.90%时最低。

表4 脱水处理对万寿竹种子丙二醛和可溶性蛋白质含量的影响

种子含水量(%)丙二醛含量(μmol/L)可溶性蛋白质含量(mg/g)(FW)49.120.31±0.0129.68±0.22c45.900.12±0.0129.77±0.25c40.500.17±0.0129.85±0.60c38.070.19±0.0629.38±0.01c33.080.29±0.2030.25±0.91bc27.260.21±0.0028.68±0.69d16.670.23±0.1233.14±0.54a14.630.26±0.0331.18±0.41b

万寿竹种子含水量从49.12%下降到33.08%的过程中,种子内可溶性蛋白质含量变化不显著,种子含水量为27.26%时,可溶性蛋白质含量最低,显著低于其他各处理;种子含水量为16.67%时,可溶性蛋白质含量最高,显著高于其他各处理。

2.5 万寿竹种子在脱水过程中种子生理生化指标与发芽率、生活力的相关分析

从表5可以看出,发芽率与生活力呈极显著正相关,与相对电导率、浸出液电导率、CAT活性、AsA-POD活性呈极显著负相关。生活力与相对电导率、浸出液电导率、CAT活性、AsA-POD活性呈极显著负相关,与可溶性蛋白质呈显著负相关。浸出液电导率与相对电导率、CAT活性、AsA-POD活性呈极显著正相关。相对电导率与CAT活性、AsA-POD活性呈极显著正相关,与可溶性蛋白质呈显著正相关,与SOD活性呈显著负相关。可溶性蛋白质与AsA-POD活性呈显著正相关。CAT活性与AsA-POD活性呈极显著正相关。

3 讨 论

万寿竹种子含水量从49.12%降至33.08%的过程中,种子的发芽率保持在73%~89%之间,生活力保持在97.00%以上,相对电导率呈缓慢上升趋势,浸出液电导率和可溶性蛋白质含量变化不显著。随着万寿竹种子进一步脱水,发芽率和生活力均开始显著下降,浸出液电导率显著上升,相对电导率上升至30.00%以上,可溶性蛋白质含量显著下降,膜蛋白受到破坏,细胞膜选择透性变差,电解质外渗,种子生活力随着含水量的降低迅速下降,表现出典型的顽拗性种子的特性,当种子含水量降至14.63%时,种子已不能发芽。

表5 不同含水量万寿竹种子各指标间相关性分析

发芽率生活力浸出液电导率相对电导率可溶性蛋白质丙二醛MDA抗坏血酸过氧化物酶过氧化物酶过氧化氢酶超氧化物歧化酶发芽率1.000生活力0.958∗∗1.000浸出液电导率-0.720∗∗-0.802∗∗1.000相对电导率-0.653∗∗-0.742∗∗0.794∗∗1.000可溶性蛋白-0.433-0.553∗0.3690.521∗1.000丙二醛MDA-0.160-0.1900.2040.1760.0041.000抗坏血酸过氧化物酶-0.880∗∗-0.893∗∗0.691∗∗0.761∗∗0.620∗0.1481.000过氧化物酶-0.077-0.0910.3170.251-0.364-0.253-0.0551.000过氧化氢酶-0.750∗∗-0.823∗∗0.813∗∗0.860∗∗0.4180.1780.823∗∗0.3781.000超氧化物歧化酶0.2250.256-0.182-0.506∗-0.4420.245-0.379-0.050-0.2841.000

注:“*”,“**”分别表示0.05和0.01的显著水平。

McDonald等研究表明,抗氧化系统活性的下降以及膜脂过氧化作用的加强是种子劣变的主要原因[20]。而本试验中,CAT活性和AsA-POD活性与种子发芽率和生活力呈极显著负相关,POD活性在种子脱水过程中变化不明显,这与前人研究结果不一致[2,11-12,16,18],究其原因,前人的大部分研究集中在正常性种子的超干处理技术上,正常性种子符合Roberts提出的种子生命公式,种子经历干燥脱水,寿命延长,活力未出现下降,抗氧化系统同时升高来修复膜系统的损伤[10];宗梅对顽拗性种子板栗做了不同脱水处理,结果表明,板栗种子经硅胶干燥脱水后,抗氧化酶活性呈先升高再降低的趋势,种子的发芽率显著下降[16];万寿竹种子属于顽拗性种子,经过硅胶脱水,CAT、POD、AsA-POD活性升高,种子发芽率显著下降,本试验未测定种胚内抗氧化酶活性,可能万寿竹种子在劣变过程中,种子内酶活性升高以修复膜系统,但胚轴内抗氧化酶系统未能有效清除有害物质,导致种子不发芽。

SOD作为专一清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基的抗氧化酶[3],保护DNA、蛋白质和细胞膜免受O2-·的破坏,在自由基清除系统中发挥着重要的作用,延缓因自由基损害而引起的种子老化。SOD活性在万寿竹种子脱水过程中活性始终未恢复至初始水平,有可能SOD活性的降低是导致万寿竹种子活力在脱水过程中下降的主要原因之一。

本试验在对万寿竹种子进行脱水过程中,获得了包括对照组在内的8个不同梯度的含水量,测定了抗氧化酶和可溶性蛋白质等生理指标,但对于万寿竹种子的非酶促抗氧化系统,二级抗氧化系统及蔗糖、淀粉等贮藏物质的含量变化未进行研究,对于导致万寿竹种子脱水失活的机制还有待进一步研究。

4 结 论

种子的安全含水量下限取决于种子的耐脱水性,Roberts根据种子的贮藏行为将种子分为正常性和顽拗性种子,Ellis等又定义了第三种类型的种子,不同类型种子脱水特性不同[1]。顽拗性种子在整个发育过程中一直保持很高的含水量和较旺盛的代谢活性,不经过成熟脱水期,在整个发育期间及脱落后对脱水敏感[19],当种子含水量下降到一定程度,种子生活力就会大幅度下降,试验结果表明,万寿竹种子含水量低于33.08%时,种子随着含水量的下降,发芽率和生活力显著下降,符合顽拗性种子的特点,因此,将万寿竹种子确定为顽拗性种子,种子贮藏的最适含水量要保持在33.00%以上。

通过本次试验得出,万寿竹种子不耐脱水属于顽拗性种子,在种子贮藏时,要保证种子的含水量在33.00%以上,这样可以有效防止万寿竹种子在贮藏过程中种子活力的下降,在生产上可以采用湿砂层积,提高环境相对湿度等方式来贮藏万寿竹种子。种子的采收也不宜过晚,避免种子在自然状态下脱水失活。

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The Effect of Dehydration on Germination Percentage and Some Indexes of Resistance ofDisporumcantonienseSeeds

ZHULi1,2,WANGHualei1,2,ZHAOZhi1,2,LIUHongchang1,2,LUOChunli1,2,LIJinling1,2,LUOFulai1,2,HUANGMingjin1,2,WANGQin1,FANGYueping1
(1.Agricultural College of Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Research Institute for Chinese Medicine of Guizhou University,Guiyang 550025,China)

[Objective]In order to provide theoretical basis forDisporumcantonienseseeds storage and harvesting,exploring the change of germination percentage and some indexes of resistance during the period of seed dehydration.[Method]The seeds ofDisporumcantoniensewere dried with silica gel to reduce the moisture content from 49.12% to 45.90%, 40.50%,38.07%,33.08%,27.26%,16.67% and 14.63%respectively under the room temperature.With the seeds in 49.12% water content as a blank control group,the seeds should be determined by different indexes,such as viability,germination percentage,conductivity,CAT,SOD,POD,AsA-POD,MDA and soluble protein content.[Result]Those seeds with moisture contents above 33.08% could remained high germination percentage and viability,the viability and germination percentage significantly decreased when seed moisture content was reduced below 44.08%.[Conclusion]TheDisporumcantonienseseeds have weak desiccation-tolerance,so the seeds belong to recalcitrant seeds.The water content should be keep at above 33.08% during seed storage period.

recalcitrant seed; antioxidant enzyme; germination percentage; viability

2016-11-22

贵州苗药百尾参繁殖技术研究(黔省专合字[2012]148号);贵州省药用植物繁育与种植人才基地(黔人领发[2013]15号);贵州省作物学重点学科建设计划项目(黔学位合字ZDXK[2014]8号)。

朱 力(1991—),男,硕士研究生,研究方向:作物栽培理论与技术;E-mail:359488117@qq.com。

王华磊,教授,主要从事药用植物资源保护与利用研究;E-mail:13027865861@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.05.006

S 330.2+9

A

1001-4705(2017)05-0006-06

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