富硒大米硒蛋白提取方法研究

梁潘霞，兰 秀，刘永贤,*，潘丽萍，农梦玲，邢 颖，廖 青，鹿士杨，陈锦平

(1. 广西农业科学院农业资源与环境研究所，广西 南宁 530007； 2. 广西大学，广西 南宁 530005)

富硒大米硒蛋白提取方法研究

梁潘霞1，兰 秀2，刘永贤1,2*，潘丽萍1，农梦玲2，邢 颖1，廖 青1，鹿士杨1，陈锦平1

(1. 广西农业科学院农业资源与环境研究所，广西 南宁 530007； 2. 广西大学，广西 南宁 530005)

【目的】优选富硒大米，研究提取分离硒蛋白的最佳生产工艺条件，为提高硒蛋白资源的开发利用提供参考。【方法】采用碱提法提取硒蛋白，正交试验法优化大米硒蛋白的提取条件，采用考马斯亮蓝 G-250 试剂结合法测定蛋白含量，原子荧光法测定硒含量。以含硒蛋白质及硒得率为指标，研究影响富硒大米中含硒蛋白质提取的因素。【结果】影响富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素为：NaOH浓度 gt; 料液比 gt; 温度 gt; 时间。富硒大米含硒蛋白提取的最佳工艺条件为提取温度 50 ℃，碱液浓度0.14 mol/L，提取时间 5 h，料液比 1∶30，此条件下硒蛋白提取率为57.11 %。【结论】采用正交试验法优化的碱提工艺可有效提高硒蛋白提取率，优化的工艺参数可在实际生产中推广应用。

富硒大米；硒蛋白；正交试验；提取率

【研究意义】微量元素硒是人体必需的营养元素。 WHO调查数据显示，目前大约有10亿人面临着硒营养不良的问题，缺硒引起的“隐性饥饿”正威胁着人类健康[1]，科学合理的补硒已经成为我们增强身体素质的重要途径。大米是我国的主要粮食之一，其可作为富硒的中间载体，提取出的大米蛋白可作为新型的富硒营养产品，具有较高的营养价值。研究开发利用富硒大米中的硒蛋白，将是一种解决国内蛋白产业缺乏问题的新思路，对有效利用富硒大米的附加值有着现实意义。【前人研究进展】张涛[2]研究发现含硒蛋白是大米中硒的主要赋予形态，占总硒的73 %，含硒蛋白中谷蛋白硒占总硒48 %。方建军等[3]研究发现富硒大米中总硒含量高达 206.71 μg/kg，有机硒是硒主要赋予形态，占总硒 81.70 %。碱溶性硒蛋白是有机硒的主要存在形式，占 53.40 %，多糖硒 9.28 %，RNA 硒占 1.86 %。 李甜[4]利用单因素及响应面分析法对新疆新春 36 号黑小麦中硒蛋白做系统考察，发现硒蛋白含量为(240.52 ± 0.3)mg/g，并摸索得到碱溶性硒蛋白提取条件为：NaOH 溶液浓度 0.17 mol/L，酸化 pH 4.7，(NH4)2SO4饱和度 66.0 %，料液比 1∶10，在此条件下得到的硒蛋白提取率为 76.7 %。王珺等[5]在采用反复冻融辅助富硒茶中硒蛋白提取工艺研究中表明：在碱液浓度 0.10 mol/L、提取时间 3 h、提取次数 2 次、温度 70 ℃、料液比 1∶60 相同条件下，反复冻融 3 次的实验组蛋白得率增长了 20 %。邹秀容[6]在通过超声波法提取米糠蛋白工艺研究中，确定最优条件为：超声时间 50 min、超声功率 380 W、料液比 1∶16，其蛋白得率达到51.66 %。Gergely[7]使用 0.1 mol/L NaOH，30 mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)与酶法从香菇中提取硒蛋白。【本研究切入点】目前植物蛋白的提取方法研究较多的是碱法、酶法以及复合提取法等，但是由于不同研究者原辅料工艺的采用和试验环境等因素不尽相同，所得的研究结论也有所差异。此外，目前国内关于富硒大米中硒蛋白的提取工艺、提取条件的优化与确证方面鲜有报道。【拟解决的关键问题】探究碱法提取富硒大米中硒蛋白的效果，获得提取的最佳工艺条件，为提高硒蛋白资源的开发利用及为增加营养食品的附加值、多样性、方便化作出有力的支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

富硒大米采自广西巴马白马村，该地区土壤硒平均含量为 (0.43 ± 1.24) mg/kg，采用大田自然栽培，常规管理。采收后的大米置于鼓风干燥箱中60 ℃下烘干，粉碎机粉碎至全部通过100目筛孔，密封置于干燥器中备用。

1.2 主要仪器与试剂

AFS双道原子荧光光度计，TDZ5-WS高速冷冻离心机，TD-5-A 离心机，ETHOS PLUS微波消解系统，紫外可见分光光度计，SHZ-88水浴恒温震荡器。NaOH、NaCl、HCl等主要试剂均为优级纯，实验用水均为超纯水。

1.3 试验方案

1.3.1 富硒大米硒蛋白提取液的筛选及提取工艺 控制大米粉末与提取液料液质量体积比为1∶20，分别用0.1 mol/L氯化钠溶液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液和水作为溶剂，常温下震荡提取3 h，25 ℃下4000 r/min 离心20 min，取一定上清液在冰浴下缓慢加入4 倍溶液体积冰丙酮于-24 ℃冰箱放置12 h 沉淀蛋白，4 ℃下10 000 r/min 离心15 min，倒掉上清液并在通风橱让丙酮挥发，得粗蛋白，测硒含量，选择最佳溶剂。

1.3.2 单因素试验 在得到最佳溶剂基础上，利用该提取剂进行单因素实验，分析不同料液质量体积比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、NaOH浓度(0.02、0.05、0.08、0.10、0.14、0.20 mol/L )、温度(20、30、40、50和60 ℃)、提取时间(1、2、3、4、5和6 h )对硒蛋白提取的影响规律。

1.3.3 正交试验 参考单因素试验结果，对料液比、NaOH 溶液浓度、提取温度和提取时间四个因素进行 L9(34)正交试验设计，通过L9(34) 正交试验确定最佳的提取条件 。每个因素水平组合试验重复3次。正交因素水平表见表1。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 硒含量测定 采用氢化物原子荧光光谱法，按照 GB/T 5009.93-2010[23]中的方法测定硒含量。

1.4.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝 G-250 试剂比色法。AA800 紫外分光光度计595 nm 处测定吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，求曲线回归方程，从而算出总蛋白质含量。

1.4.3 硒得率的计算

其中,A为从大米中所提取出的蛋白质的质量分数，B为蛋白质中硒的质量分数 ，C为大米中硒的质量分数。

表1 正交因素水平

图1 不同溶剂对硒得率的影响Fig.1 Effect of different solvents on selenium extraction yield

1.5 统计分析

采用Excel 2003 和SPSS 17.0系统分析软件对测定的各个指标数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

由图1 可知，以硒得率为指标，NaOH 提取硒蛋白效果最好 , 硒得率为52.21 %，是水提取的7倍，四种提取剂提取硒蛋白效率从高到低为NaOH gt; NaCl gt; HCl gt; H2O，因此采取NaOH作为提取剂。

2.2 单因素试验

在保持其他条件不变(提取液浓度为0.1 mol /L、提取温度为常温，提取时间3 h)，改变液料比，由图2可知，随着液料比的增大，大米蛋白质提取率先升高后下降，液料比増加到1∶40 时，提取率达到最高值15.56 %，硒含量1.08 μg/g，而液料比从1∶50到1∶60，提取率急速下降。因此，1∶40 g/mL是单因素实验优化的最佳料液比。

2.3 提取时间对大米硒蛋白提取效果的影响

在保持其他条件不变(提取液浓度为 0.1 mol/L、提取温度为常温，液料比为 1∶20)，改变提取时间，大米硒蛋白提取率随提取时间的变化如图3所示。一定条件下，提取时间-提取率曲线呈现先升高后降低的趋势，在 4 h 时蛋白提取率达到峰值15.45

图2 不同料液比对硒蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of selenoproteins

图3 提取时间对硒蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of selenoproteins

%；此时硒含量也达到最大 1.11 μg/g，提取时间超过 4 h后蛋白的提取率反而呈现下降趋势，这可能是因为蛋白质分子溶胀导致溶出率降低。因此，4 h 是单因素实验优化的最佳提取时间。

2.4 提取温度对大米蛋白提取效果的影响

在保持其他条件不变(提取液浓度为0.1 mol /L、提取时间3 h，液料比为1∶20)，改变提取温度，由图4可知，当提取温度在20 ℃ 升高到40 ℃ 时，大米蛋白提取率随着温度的升高而增加，40 ℃时达到最大，增幅为20 ℃的10.07 %；随着提取温度的进一步上升，提取率反而呈下降趋势。因此，确定单因素实验优化硒蛋白的提取最佳温度为40 ℃。

2.5 碱液浓度对大米蛋白提取率效果的影响

在保持其他条件不变(提取时间3 h、提取温度为常温，液料比为1∶20)，改变提取液浓度，由图5可知，大米硒蛋白提取率随提取液浓度的升高而缓慢提高后快速下降，在浓度为0.02 ～ 0.08 mol/L范围内，提取率变化不大，在0.08 ～ 0.14 mol/L范围时，提取率变化显著，在0.14 mol/L是提取率达到最高值28.07 %，碱液浓度为0.2 mol/L时，提取率最低。因此，碱液浓度0.14 mol/L是单因素实验优化的最佳提取液浓度。

图4 提取温度对硒蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of selenoproteins

图5 碱液浓度对硒蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of alkali concentration on the extraction rate of selenoproteins

试验号NumberA.料液比(g/mL)Solid-liquidratioB.氢氧化钠浓度(mol/L)ConcentrationC.温度(℃)TemperatureD.时间(h)Time提取率(%)Extractionrate11∶300.0830344.85±3.521∶300.140452.78±4.831∶300.1450557.11±2.741∶400.0830526.82±3.351∶400.140345.52±5.161∶400.1450441.68±4.271∶500.0830434.76±3.681∶500.140546.45±4.391∶500.1450355.73±2.9K151.5835.4845.6048.70-K23848.2545.1144.35-K345.6251.5145.8043.46-R7.079.5276.23-

注：表中数据为 3 次重复平均值±标准误差；K-各因素水平的平均蛋白提取率，R-各因素水平平均蛋白提取率极差。

Note:Values are means of three determinations ± standard deviation;Krepresents the average extraction rate of protein;Rvalue means range between average extraction rate of protein.

2.6 正交试验结果

由表2中的极差R值可以看出，氢氧化钠浓度是影响提取率的最主要因素，其次为料液比，浸提温度和浸提时间对提取率影响较小。组合 A1B3C3D3提取率最高，即料液比 1∶30 g/mL、氢氧化钠浓度0.14 mol/L、提取温度 50 ℃、提取时间 5 h，此条件下提取率为 57.11 %。

3 讨 论

本研究中的最佳的提取剂为NaOH溶液，这与前人的研究结果一致[8]。这可能与大米中的氢键、酰胺键和二硫键在高浓度碱条件下水解，进而释放更多的蛋白质有关[9-11]。Fang 等[12]研究表明，通过提取大米中4 类蛋白，分析蛋白中硒的含量，发现硒主要存在于碱溶谷蛋白中。胡秋辉等[13]研究表明，清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白，Se主要存在于分子量较大的碱溶谷蛋白和球蛋白中，且碱溶含硒蛋白为主要组分。张帅等[14]的研究也表明，碱提法工艺成本低，提取率高、提取方法简单。

在获得最佳提取剂的基础上，以提取剂浓度、料液比、提取时间和提取温度进行单因素试验，硒蛋白提取率开始随着碱液浓度的增大而明显增大，但在0.14 mol/L后开始下降。这与彭炜[8]的研究结果有相似之处。这可能是因为溶液pH值可以直接改变两性分子蛋白质的表面所带电荷，进而对蛋白质与蛋白质、蛋白质与溶剂间的相互作用造成影响，从而改变蛋白质的溶解性。有研究表明，蛋白质溶解度在pH 大于7时显著升高，在pH 大于12 时，90 %以上的蛋白质可溶出[15]。碱法提取条件不同时蛋白提取率结果就会不同，有研究表明，提取蛋白时，提取液浓度不宜过高，否则会导致蛋白质中赖氨酸与丙氨酸或胱氨酸发生缩合反应[16]，蛋白质难以溶出，降低蛋白质的纯度和品质，从而影响蛋白质的营养价值与商用价值，导致提取率的下降[17]。

本研究发现提取率随着料液比增大而增大，但在一定比例后开始下降。这与曹斌[18]在用碱法提取恩施碎米荠时的试验结果一致。这可能是因为提取溶剂在料液比较低时粘度大，蛋白浓度较高，蛋白质分子间的斥力大，蛋白质的扩散作用小，因此提取速率较低。随着料液比的增加，提取溶剂粘度下降、分子间的斥力减小，蛋白质的扩散作用变大，并不断溶出，提取率则不断上升。然而当料液比继续增大时，提取率不升反降，原因可能是高的料液比增大了提取难度，造成了提取率的下降。

本研究提取温度单因素试验结果表明，在提取温度大于40 ℃以后，提取率开始下降。有研究表明，随着的温度的增高，蛋白质的三维立体结构发生伸展，增大了其与水分子的相互作用，且分子的扩散作用随着温度的增高而增高，加快了蛋白质的溶解速率，但增加到一定温度时，蛋白质空间结构被破坏，其疏水集团暴露，导致蛋白质的溶解度下降，提取率降低[19-21]。吕佼[24]在对板栗蛋白提取工艺优化研究中发现，板栗蛋白提取率随着温度的升高而降低，这可能是由于板栗淀粉发生糊化作用，与蛋白质结合，使蛋白质溶解率下降，从而降低蛋白质的提取率。在提取时间1～4 h范围内，硒蛋白提取率随着提取时间的增加而增加，这可能是因为与硒结合能力强的蛋白质不断溶解有关[22]。 当提取时间超过4 h时，蛋白的提取率反而呈现下降趋势，这可能是因为蛋白质分子溶胀导致溶出率降低。

参考单因素试验结果，对料液比、NaOH 溶液浓度、提取温度和提取时间四个因素进行 L9(34)正交试验，发现 9个组合的蛋白提取率均比单因素试验高，那是因为多因素实验中， 每个因素都不是单独发挥作用，因素间存在相互作用，具有强烈的搭配效果。通过比较极差R值大小，得到各因素对提取率的影响大小为NaOH浓度 gt; 料液比 gt; 提取温度 gt; 提取时间。最后方差分析得到的最佳提取条件A1B3C3D3。

虽然碱提取法具有成本低廉、易于操作和控制的优点，但是需要较长的提取的时间，提取效果也未达到最佳。因此，还可通过复合法提取法，例如加入超声波辅助提取、碱法与酶法结合，或采用微射流辅助法来提高硒蛋白提取率。广西硒资源十分丰富，随着对大米硒蛋白更深入的研究，包括提取硒蛋白的工艺、硒蛋白基础理论特性及功能和利用价值等方面，大米硒蛋白将有望广泛地应用于营养保健、医疗和食品行业上，这不仅能节约资源，而且能为丰富大米资源的开发利用开辟新的思路，使大米得到深层次的开发与应用，将资源优势转化为经济优势具有重要的理论和现实意义。

4 结 论

影响富硒大米含硒蛋白提取率的主次因素为：NaOH浓度 gt; 料液比 gt; 温度 gt; 时间，富硒大米含硒蛋白提取的最佳工艺条件为提取温度 50 ℃，碱液浓度0.14 mol/L，提取时间5 h，料液比 1∶30。采用正交试验法优化的碱提工艺可有效提高硒蛋白提取率，优化的工艺参数可在实际生产中推广应用。

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(责任编辑 韦 幂)

StudyonExtractionMethodofSe-enrichedRice

LIANG Pan-xia1, LAN Xiu2, LIU Yong-xian1,2*, PAN Li-ping1, NONG Meng-ling2,XING Ying1, LIAO Qing1，LU Shi-yang1，CHEN Jin-ping1

(1.Resources and Environment Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007, China；2.Guangxi University，Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】 The study aims to optimize the extraction process of selenoproteins from selenium-enriched rice in Guangxi and provide reference for the exploitation and utilization of selenium protein resources. 【Method】Selenium-enriched rice was used as materials to extract selenoproteins by alkali extraction method and to optimize the extraction process of selenoproteins by using the orthogonal experiment. Proteins and selenium content were measured by coomassie brilliant blue G-250 reagent and AFS (atomic fluorescence spectrometry) respectively.【Result】The most significant factor affecting extraction of rice selenoproteins was sodium hydroxide concentration , followed by the ratio of solid-liquid, temperature and then extraction time. The optimum extraction conditions of rice selenoproteins: extraction temperature was 50 ℃, sodium hydroxide concentration was 0.14 mol/L, extraction time was 5h, and the ratio of solid-liquid was 1∶30.【Conclusion】The alkali extraction process optimized by orthogonal test can effectively improve the extraction rate of selenium protein, and the optimized process parameters can be popularized and applied in practical production.

Selenium-enriched rice；Selenoproteins；Orthogonal experiment；Extraction efficiency

S38

A

1001-4829(2017)11-2474-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.014

2017-05-25

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科合415104 001-22)；广西农业科学院基本科研业务专项资助项目(桂农科2017YZ03)；广西重点研发计划(桂科AB16380088)；广西富硒特色作物试验站(桂TS2016011)；南宁市青秀区重点研发计划(2016039)；广西农业科学院科技成果转化项目(2017NZ04)

梁潘霞(1979-)，女，广西邕宁人，博士，助理研究员，主要从事土壤环境生态、植物生理生化和生物技术研究，E-mail：lpx831@163. com,*为通讯作者，刘永贤，E-mail：liuyx27@163.com。