电针百会、大椎、肾俞穴对SAMP8小鼠学习记忆与海马CA1区神经元突触的影响

李斐斐，杨珺，杨文丹，骆雍阳，陈慧娥，宋长明，董卫国

电针百会、大椎、肾俞穴对SAMP8小鼠学习记忆与海马CA1区神经元突触的影响

李斐斐1，杨珺2，杨文丹1，骆雍阳1，陈慧娥1，宋长明3，董卫国4

目的 观察电针百会、大椎、肾俞穴对SAMP8小鼠学习记忆与海马CA1区神经元突触的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病(AD)的机制。方法 7月龄SAMP8小鼠24只随机分为模型组和电针组，同龄正常老化SAMR1小鼠12只为对照组。电针组电针百会、大椎、肾俞穴30 d。Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力，免疫组织化学观察小鼠海马CA1区突触素(SYN)及突触后致密区蛋白95(PSD95)的表达，透射电镜观察小鼠海马CA1区突触超微结构的变化。结果 与模型组相比，电针组逃避潜伏期缩短(p＜0.05)，原平台象限停留时间延长(p＜0.05)，穿越原平台次数增加(p＜0.05)，海马CA1区SYN与PSD95表达显著提高(p＜0.001)，突触结构较完整，数量增加。结论 电针能提高小鼠海马CA1区神经元突触蛋白的表达，改善突触的超微结构，从而有效改善SAMP8小鼠的学习记忆能力。

阿尔茨海默病；电针；学习记忆；突触素；突触后致密区蛋白95；小鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又称为老年性痴呆，是一种与年龄相关、以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的中枢神经系统退行性疾病[1]。AD的主要病理特征为细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉积形成的老年斑和细胞内高度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结[2]。突触障碍，包括突触功能障碍和突触丢失，是AD早期病理特征[3-4]。AD患者脑组织突触数量减少，突触密度下降，突触蛋白表达水平降低，包括突触前膜蛋白突触素(synaptophysin,SYN)及突触后致密区蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)表达明显下降[5]。

我们前期研究表明，益肾调督法电针能改善快速老化模型小鼠亚系(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)小鼠学习记忆能力[6-7]。本研究观察电针对SAMP8小鼠学习记忆、海马CA1区SYN及PSD95的表达、突触结构的影响，为电针防治AD提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7月龄SAMP8小鼠24只，雄性，体质量20～25 g，由北京维华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物质量合格证编号SCXK(京)2014-0004。7月龄抗快速老化小鼠亚系(senescence-accelerated resistant mouse 1,SAMR1)小鼠12只，雄性，体质量20～25 g，由北京大学医学部(实验动物中心)提供，实验动物质量合格证编号SCXK(京)2011-0012。

动物实验前在福建中医药大学动物实验中心(合格证号医动学第23-016号)适应性喂养1个月，温度(22±2)℃，湿度(55±15)%，12 h明暗交替，自由进食与饮水。

实验过程严格按国际动物保护及使用指南进行。

1.2 主要仪器及试剂

华佗牌无菌针灸针(直径0.25 mm，长15 mm)、华佗牌SDZ-Ⅱ电针仪：苏州医疗用品厂有限公司。Morris水迷宫系统：中国医学科学院药物研究所。H-7650型透射电镜：日本HITACHI公司。电镜CCD相机-图像采集分析系统：德国Soft-Imaging-System公司。

兔SYN单克隆抗体、兔PSD95单克隆抗体：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。生物素标记的羊抗兔IgG超敏试剂盒与DAB试剂盒：福州迈新生物工程有限公司。Motic Med 6.0数码医学图像分析系统。

1.3 动物分组及干预

采用随机数字表法将7月龄SAMP8小鼠分为模型组和电针组，每组12只；SAMR1小鼠作为对照组。

电针组采用电针治疗。参照《实验针灸学》[8]取百会、大椎、双侧肾俞，百会向前斜刺2 mm，大椎向下斜刺2～3 mm，肾俞稍向内斜刺3～4 mm。大椎、肾俞加电针，肾俞双侧交替进行。自制网兜固定小鼠，进针后，不进行手法刺激，连接电针仪，连续波，频率2 Hz，电压2 V，留针20 min[6]。每天1次，8 d为1个疗程。疗程间隔2 d进行下一个疗程，共3个疗程，30 d。

模型组与对照组不进行电针治疗，只进行相同方式、相同时间和相同程度的抓取和固定。

1.4 Morris水迷宫

Morris水迷宫为直径120 cm、高60 cm、水深15 cm圆形水池；控制水温为(25±2)℃；圆形平台直径8 cm，置于第3象限，没于水下1 cm；圆形水池侧面均表面光滑。

电针治疗结束后开始定位航行实验。每天上、下午各训练小鼠4次，将小鼠分别从4个入水点(各象限池壁中点)面向池壁放入水中，记录小鼠爬上平台所需时间，即逃避潜伏期；如90 s内未找到平台，则将其引至平台并在平台停留10 s，记录逃避潜伏期为90 s。连续训练5 d。

第6天撤去平台，进行空间探索实验。小鼠从第1象限池壁中点放入池中，自由游泳90 s后。记录小鼠在原平台区域停留的时间与跨越平台次数。

1.5 免疫组织化学染色法

水迷宫测试结束后，各组取6只小鼠，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳。快速注入37℃生理盐水80 ml冲洗，后注入4%多聚甲醛80 ml灌流固定。

取全脑修块后迅速放入4%多聚甲醛内，4℃固定24～48 h。常规梯度酒精脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。自上丘至视交叉节段作连续冠状切片，厚4 μm。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，将黏附脑组织的载玻片置于0.01 mol/L柠檬酸修复液(pH=7.4)中，微波炉法修复7 min，降至室温。分别加入SYN抗体(1∶700)、PSD95抗体(1∶200)，4℃湿盒孵育过夜。加入生物素标记的羊抗兔IgG的二抗，DAB显色，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。

用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对海马CA1区SYN及PSD95的图片进行分析，计算SYN及PSD95的平均光密度(mean optical density,MOD)。

1.6 透射电镜观察

另6只小鼠同法取脑组织，置于2.5%戊二醛固定液中，分离出海马，切取左右侧海马CA1区约1 mm3各3～4块，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d，1%四氧化饿后固定2 h，梯度乙醇、丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋，37℃、45℃、60℃分别聚合，常规半薄切片，美兰-天青染色，光镜辅助观察并定位。常规超薄切片，铜网捞片，切片2%醋酸铀水溶液染色20 min，柠檬酸铅染色15 min。透射电镜先在低倍下定位和观察海马神经元细胞，再在高倍下观察突触形态。电镜CCD相机进行图像采集。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。数据用(xˉ±s)表示，均符合正态分布，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

定位航行实验中，对照组逃避潜伏期明显短于模型组(p＜0.01)；与模型组比较，电针组逃避潜伏期缩短(p＜0.05)。见表1。

空间探索实验中，与对照组相比，模型组原平台象限停留时间明显缩短(p＜0.01)，跨越平台的次数明显减少(p＜0.01)。与模型组相比，电针组原平台象限停留时间延长(p＜0.05)，跨越平台的次数增多(p＜0.05)。见表2、图1。

2.2 免疫组织化学染色

光镜下小鼠海马CA1区神经元SYN主要表达于神经元细胞膜、细胞质。对照组SYN阳性表达最明显，平均光密度值显著高于模型组(p＜0.001)。与模型组相比，电针组平均光密度显著增高(p＜0.001)。

PSD95主要表达于神经元细胞膜。对照组PSD95平均光密度显著高于模型组(p＜0.001)，电针组平均光密度显著高于模型组(p＜0.001)。见表3、图2、图3。

2.3 透射电镜

对照组突触结构完整，突触前、后膜分界清晰，突触小泡密集。模型组可见突触间隙增大或消失，前后膜不清晰，突触小泡减少，突触后致密物质变薄。与模型组相比，电针组突触结构较完整，突触前、后膜分界较清晰，突触小泡较多。见图4。

表1 各组定位航行实验逃避潜伏期比较(s)

表2 各组空间探索实验原平台停留的时间及跨越平台次数比较

表3 各组小鼠海马CA1区SYN与PSD95比较(MOD)

图1 空间探索实验各组小鼠游泳轨迹

图2 各组小鼠海马CA1区SYN的表达(免疫组化染色，bar=50 μm)

图3 各组小鼠海马CA1区PSD95的表达(免疫组化染色，bar=50 μm)

图4 各组小鼠海马CA1区神经元突触超微结构(透射电镜，50,000×)

3 讨论

AD在中医学中属于“痴呆”“健忘”“呆病”“癫狂”“郁证”“虚劳”等范畴。中医认为引起本病的根本原因是肝肾亏虚、气血不足、经脉失养髓海不充。人至老年，肾衰髓虚，髓减则脑消，神机失用而成痴呆。罗磊等[9]发现，益肾调督针灸法可能通过调节线粒体分裂与融合蛋白的失衡，改善线粒体动力学异常，从而改善线粒体损伤，保护线粒体功能。何勋等[10]研究表明，益肾调督针灸法能够通过改善AD发病过程中线粒体动力学异常，达到防治AD的目的。崔翔等[11]发现，益肾调督针灸法可以有效抑制海马线粒体Cyp D表达，从而阻滞线粒体通透性转换孔的形成，减少线粒体损伤。陈阳阳等[12]研究发现，益肾调督针加灸法可能通过减少或抑制AD大鼠血清内Aβ水平，降低大鼠海马CA1区淀粉样前体蛋白的表达，延缓AD的病理进程。

根据文献[9-12]和我们前期研究[7,13]，本实验中我们以益肾调督为电针治疗的基本原则，选择大椎、百会、肾俞为治疗腧穴。百会和大椎属督脉穴，两穴结合可使诸经通调，促进经气运行，增强联络各脏腑经络的功效，濡养脑髓气血，促进阴阳平衡。肾俞为肾的背俞穴，肾中精气汇集于此；肾经与督脉相连，入髓连络脑海。三穴相配共奏益肾调督的作用。

SAMP8小鼠由日本京都大学竹田俊男培育成功[14]，主要特征是学习记忆功能随增龄进行性快速衰退[15]，与AD临床表现非常相似。另外，SAMP8小鼠具有多种与人类AD相类似的病理改变[16]，被公认为较理想的AD模型[17]，已广泛应用于AD的研究。SAMR1具有与SAMP8相似的遗传背景，但没有表现衰老相关的神经显型，被广泛用于AD模型的对照。

Morris水迷宫是目前最常用的评价动物学习和记忆能力的装置[18]。Li等[19]对SAMP8小鼠进行水迷宫测试发现电针组平均逃避潜伏期明显缩短。李向宇等[20]对APP/PS1小鼠进行水迷宫测试，结果显示电针组平均逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间与穿越平台次数增加。与本研究结果一致，提示电针治疗可以有效提高SAMP8小鼠的学习记忆能力。

突触是神经元传递信息的主要结构，是学习与记忆形成的重要形态学和功能学基础[21]。SYN是一种与突触结构和功能密切相关的钙结合蛋白，位于突触囊泡膜上，是突触前膜特异性标记物，可反映突触的分布、数量和密度，与突触的可塑性密切相关[22]。PSD95是突触后膜上最重要、最丰富的脚手架蛋白，在突触结构、功能和可塑性方面发挥重要作用[23]。SYN与PSD95作为突触的特异性标志蛋白，在维持突触正常功能和可塑性方面具有重要作用，也是治疗干预的重要靶点。AD患者及AD模型动物海马SYN与PSD95表达均减少[5,24]。海马结构中CA1区是学习记忆、信息处理和信息传递的重要部位[25]。

张亢亢等[26]研究表明，电针治疗能有效提高AD大鼠海马神经元SYN和PSD-95蛋白的表达。余曙光等[27]研究发现，电针组大鼠海马CA1区突触密度增大，突触面平均面积减小，提示电针治疗可在一定程度上修复AD模型大鼠海马神经元突触形态，抑制海马神经元突触退变，从而发挥治疗AD的作用。王威等[28]研究表明，电针治疗明显增加突触面积与体积密度，突触素表达水平提高。宋长明等[29]研究表明，电针增加CA1区神经元的突触数量，改善突触超微结构。

本研究显示，电针既能增强海马CA1区SYN和PSD95蛋白表达，又有利于保持突触结构的完整，增加突触小泡。提示电针既能改善SAMP8小鼠突触结构又能提高突触功能。

综上所述，本研究显示，电针百会、大椎、肾俞穴能有效改善SAMP8小鼠的学习记忆能力，提高小鼠海马CA1区神经元突触蛋白的表达，改善突触的超微结构。可能与电针改善海马突触的结构和功能有关。下一步我们将进一步研究电针改善AD突触功能的分子机制，为AD的治疗提供靶点。

[1]周勇,王炎,刘丽娜.哌罗匹隆与喹硫平治疗老年痴呆患者精神行为症状的对照研究[J].中国临床药理学与治疗学,2013,18(1):90-94.

[2]Querfurth HW,La Ferla FM.Alzheimer's disease[J].N Engl J Med,2010,362(4):329-344.

[3]Sheng M,Sabatini BL,Sudhof TC.Synapses and Alzheimer's disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2012,4(5):747-749.

[4]Selkoe DJ.Alzheimer's disease is a synaptic failure[J].Science,2002,298(5594):789-791.

[5]Yuki D,Sugiura Y,Zaima N,et al.DHA-PC and PSD-95 decrease after loss of synaptophysin and before neuronal loss in patients withAlzheimer's disease[J].Sci Rep,2014,4(4):7130.

[6]Dong W,Guo W,Zheng X,et al.Electroacupuncture improves cognitive deficits associated with AMPK activation in SAMP8 mice[J].Metab Brain Dis,2015,30(3):777-784.

[7]董卫国,林岚,王丰,等.电针对SAMP8小鼠海马线粒体呼吸链功能的影响[J].中国针灸,2012,32(8):726-730.

[8]余曙光,郭义.实验针灸学[M].北京:人民卫生出版社,2012:252.

[9]罗磊,孙国杰,杜艳军,等.“益肾调督”针灸法对阿尔茨海默病大鼠海马神经元线粒体动力学相关蛋白的影响[J].针刺研究,2015,40(4):270-274.

[10]何勋,于杰,孙国杰,等.益肾调督法针灸对阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元线粒体融合蛋白的影响[J].中国预防医学杂志,2014,15(3):187-190.

[11]崔翔,马冉,唐萁,等.益肾调督针灸法对AD大鼠海马线粒体CypD的影响[J].中华中医药杂志,2014,29(7):2374-2376.

[12]陈阳阳,孔立红,孙国杰,等.“益肾调督”针灸法对AD大鼠血清Aβ及海马APP表达的影响[J].时珍国医国药,2016,27(9):2289-2291.

[13]王丰,吕东,李长征,等.电针对SAMP8小鼠海马Beclin-1表达的影响[J].山西医科大学学报,2015,46(8):721-723.

[14]Tskeda T.Senescence-accelerated mouse(SAM)with special references to neurodegeneration models,SAMP8 and SAMP10 mice[J].Neurochem Res,2009,34(4):639-659.

[15]马芹颖,强静,王铭维.快速老化小鼠SAMP8脑内神经病理学变化的研究进展[J].中国老年学杂志,2011,31(19):3858-3860.

[16]Manich G,Mercader C,del Valle J,et al.Characterization of amyloid-β granules in the hippocampus of SAMP8 mice[J].J Alzheimers Dis,2011,25(3):535-546.

[17]Morley JE,Farr SA,Kumar VB,et al.The SAMP8 mouse:a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease[J].Curr Pharm Des,2012,18(8):1123-1130.

[18]Huang KY,Liang S,Yu ML,et al.A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals[J].BMC Complement Altern Med,2016,16(1):297.

[19]Li G,Zhang X,Cheng H,et al.Acupuncture improves cognitive deficits and increases neuron density of the hippocampus in middle-aged SAMP8 mice[J].Acupunct Ned,2012,30(4):339-345.

[20]李向宇,徐乐,柳垂亮,等.电针对异氟醚引起的APPswe/PS1dE9小鼠学习记忆能力及海马激活型Caspase-3、Bcl-2/Bax变化的影响[J].针刺研究,2016,41(1):24-30.

[21]张永杰,唐冬梅,徐桂萍.突触可塑性分子机制的相关研究[J].医学综述,2012,18(8):1141-1143.

[22]Kwon SE,Chapman ER.Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons[J].Neuron,2011,70(5):847-854.

[23]Pan W,Han S,Kang L,et al.Effects of dihydrotestosterone on synaptic plasticity of the hippocampus in mild cognitive impairment males SAMP8 mice[J].Exp Ther Med,2016,12(3):1455-1463.

[24]Wang J,Yuan J,Pang J,et al.Effects of chronic stress on cognition in male SAMP8 mice[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(3):1078-1086.

[25]于萍,袁水霞,李霞,等.记忆过程中海马CA1区神经元的集群放电特征[J].心理学报,2011,43(8):917-928.

[26]张亢亢,孔立红,王颖,等.不同频率电针对AD大鼠海马CA1区突触素和PSD-95表达的影响[J].时珍国医药,2016,27(10):2539-2542.

[27]余曙光,罗松,韩婷,等.电针对老年性痴呆大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响研究[J].中华神经医学杂志,2006,5(4):369-371.

[28]王威,唐伟,孙忠人.电针对拟老年性痴呆大鼠学习记忆功能和海马CA1区突触表达的影响[J].中国中医药科技,2011,18(1):1-2.

[29]宋长明,黄佳,林冰冰,等.电针百会、神庭穴对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马CA1区突触超微结构的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(7):750-755.

Effects of Electroacupuncture at Baihui,Dazhui and Shenshu Acupoints on Ability of Learning and Memory and Synapses of Neurons in Hippocampal CA1 in SAMP8 Mice

LI Fei-fei1,YANG Jun2,YANG Wen-dan1,LUO Yong-yang1,CHEN Hui-e1,SONG Chang-ming3,DONG Wei-guo4
1.College of Acupuncture and Moxibustion,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2.Lanzhou Hospital of Gansu Provincial Prison Administration,Lanzhou,Gansu 730000,China;3.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;4.College of Integrated Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China

DONG Wei-guo.E-mail:fjdwg601@163.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture(EA)at Baihui(GV20),Dazhui(GV14)and Shenshu(BL23)acupoints on cognitive function and the synapse of neurons in hippocampal CA1 in SAMP8 mice,to explore the mechanism of EA in the treatment of Alzheimer's disease(AD).Methods A total of 24 seven-month-old SAMP8 mice were randomly divided into model group(n=12)and EA group(n=12),and the same age SAMR1 mice were as control group(n=12).The EA group accepted EA at Baihui,Dazhui and Shenshu for 30 days.They were assessed with Morris maze test.The expression of synaptophysin(SYN)and postsynaptic density protein 95(PSD95)in hippocampal CA1 region were detected with immunohistochemistry.The morphology and density of synapse in hippocampal CA1 region was observed with transmission electron microscopy.Results Compared with the model group,the latency of Morris maze decreased in EA group(p＜0.05),the time staying in the quadrant of the platform increased(p＜0.05),as well as the number passing the original platform(p＜0.05),with the more expression of SYN and PSD95 in hippocampal CA1 region(p＜0.001),and more and completed synapse.Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice by increasing the expression of SYN and PSD95 to protect the ultrastructure of synapses in hippocampal CA1 region.

Alzheimer's disease;electroacupuncture;learning and memory;synaptophysin;postsynaptic density protein 95;mice

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.008

R749.1

A

1006-9771(2017)11-1278-06

1.国家自然科学基金项目(No.81102625)；2.福建省自然科学基金项目(No.2017J01541)；3.福建省中医药科研项目(No.2017FJZYJC102)；4.2015年度福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目。

1.福建中医药大学针灸学院，福建福州市350122；2.甘肃省监狱管理局兰州医院，甘肃兰州市730000；3.福建中医药大学康复学院，福建福州市350122；4.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州市350122。作者简介：李斐斐(1990-)，女，汉族，福建龙岩市人，硕士研究生，主要研究方向：针灸防治老年性疾病的基础与临床研究。通讯作者：董卫国(1977-)，男，汉族，湖北红安县人，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向：针灸防治老年性疾病的基础与临床研究。E-mail:fjdwg601@163.com。

[本文著录格式] 李斐斐，杨珺，杨文丹，等.电针百会、大椎、肾俞穴对SAMP8小鼠学习记忆与海马CA1区神经元突触的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(11):1278-1283.

CITED AS:Li FF,Yang J,Yang WD,et al.Effects of electroacupuncture at Baihui,Dazhui and Shenshu acupoints on ability of learning and memory and synapses of neurons in hippocampal CA1 in SAMP8 mice[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1278-1283.

2017-06-16

2017-08-01)