利拉鲁肽对急性心肌梗死大鼠血管新生和心肌保护的影响及机制研究

卢慧芳，方义杰，李玥，黄涌泉，罗礼云，林岫芳

基础与实验研究

利拉鲁肽对急性心肌梗死大鼠血管新生和心肌保护的影响及机制研究

卢慧芳，方义杰，李玥，黄涌泉，罗礼云，林岫芳

目的：观察利拉鲁肽对急性心肌梗死大鼠心肌血管新生的影响及其心肌保护作用。

方法：冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功建模的大鼠随机分为三组（每组6只）：对照组、利拉鲁肽低剂量组（LS组）和利拉鲁肽高剂量组（HS组），另外取6只大鼠仅穿线，不结扎，作为假手术组。LS组和HS组建模后分别腹腔皮下注射利拉鲁肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手术组和对照组均注射相应生理盐水，每天1次，共2周。4周后，超声心动图评估大鼠心脏结构及功能，HE染色观察心肌组织形态学变化，Masson染色计算胶原容积分数（CVF），免疫组织化学法检测大鼠心肌梗死边缘区微血管密度（MVD）及血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测VEGF蛋白含量。

结果：4周后，对照组较假手术组左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）均明显减低，左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）及CVF明显增加（P均＜0.01），而MVD及VEGF蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，LS组和HS组LVEF、LVFS明显升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd降低（P＜0.05），CVF明显下降（P＜0.01），MVD及VEGF蛋白水平显著增加（P＜0.01）；HS组较LS组LVEF、LVFS明显升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd和CVF下降（P＜0.05），MVD及VEGF蛋白水平增加（P＜0.01或P＜0.05）。

结论：利拉鲁肽可促进急性心肌梗死大鼠血管新生，可能与增加VEGF蛋白表达有关，并可减少胶原沉积，从而改善左心室收缩功能，发挥心肌保护作用，且与剂量有一定关系。

心肌梗死；血管新生；利拉鲁肽

心血管疾病（cardiac vascular disease, CVD）是威胁人类健康的重大疾病之一，中国心血管病报告2015显示，每5例死亡者中就有2例死于心血管病，并且数量在逐年增加[1]。而糖尿病亦是世界重大公共卫生问题之一，糖尿病患者CVD的死亡率增加了2 倍多[2]，超过一半的冠心病患者合并糖尿病[3，4]。因此，大多数冠心病患者需要接受降糖药等多种药物综合治疗，而传统降糖药物在合并CVD时应用受限，因此既能控制血糖又有心血管益处的降糖药物备受青睐。目前，胰高糖素样多肽-l（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受体激动剂广泛的药理学作用颇受关注，GLP-1及其类似物在降血糖的同时，对心肌、血管、肾脏等有一定的保护作用[5，6]。利拉鲁肽是常用的GLP-1受体激动剂，在糖尿病合并心血管疾病中的应用是目前的研究热点，具有独立于降血糖之外的心血管益处[7]，但其对心肌梗死后血管新生的影响却鲜有报道。本研究将通过动物实验对相关机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

SPF级雄性SD(Sprague—Dawley)大鼠，体重220～250 g，由南方医科大学实验动物中心提供。戊巴比妥钠购自上海西唐科技有限公司。血管内皮生长因子（VEGF）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购于美国Abcam公司，CD31抗体购自武汉博士德公司。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型的建立及分组干预

参照文献[8]，所有实验大鼠术前禁食、禁饮12 h，称重后用l%戊巴比妥钠(30～45 mg/kg)腹腔内注射麻醉，经口气管插管后连接小动物呼吸机(呼吸机参数：呼吸比2：1，潮气量30 ml/kg，呼吸频率65～80次/min)，无菌操作下于左胸前区第三、四肋间行胸廓切开术，暴露心脏，撕开心包，于左心耳下缘2～3 mm处用6-O缝合线结扎左冠状动脉前降支，进针深度约2 mm，做两次外科手术结扎打结。结扎后肉眼可见结扎局部下方和左心室前壁呈灰白至紫绀，室壁运动减弱，且心电图Ⅱ导联R波增高伴明显切迹（ST段抬高）并持续15 min以上即为心肌梗死模型结扎成功标志。抽吸胸腔后负压关胸，逐层缝合胸腔，逐渐撤停呼吸机，待大鼠呼吸稳定，清醒后拔出气管插管，放入笼内继续饲养4周（室内温度24℃～26℃）。

造模成功的18只大鼠采用随机数字表法分为三组（每组6只）：对照组、利拉鲁肽低剂量组（LS组）和利拉鲁肽高剂量组（HS组），另取6只作假手术组仅穿线，不结扎，余操作同建模过程。LS组和HS组分别腹腔皮下注射利拉鲁肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手术组和对照组均注射等量生理盐水，1次/d，连续2周。

1.3 超声心动图评估心脏结构及功能

建模前及建模后4周，大鼠在戊巴比妥钠麻醉状态下行经胸超声心动图（飞利浦IE33，12 MHz探头）检查，以胸骨旁短轴切面，测量左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）、左心室短轴缩短率（LVFS）和左心室射血分数（LVEF）。心肌收缩力参数根据同一水平短轴切面获取，每个切面记录两个图像，每个参数参量记录连续3个心脏搏动。

1.4 急性心肌梗死大鼠模型心脏标本采集

4周后，所有大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，迅速剪取心脏，4℃生理盐水反复冲洗残余血液，滤纸吸干，除去右心室、心房和大血管。在左心室长轴中点处垂直于长轴将左心室一分为二，心尖侧的一半心肌组织经4%甲醛溶液中固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋，制备厚度5 μm的组织切片。苏木精-伊红染色（HE染色）光镜下观察心肌组织形态学变化，Masson染色观察胶原沉积情况和免疫组织化学染色观察血管新生的影响；另一半心肌组织置于液氮中保存，用于蛋白免疫印迹（Western blot）法检测。

1.5 心肌胶原容积分数（CVF）测定

Masson胶原染色，胶原纤维染呈蓝色，肌肉呈红色，200倍光镜下在心肌梗死边缘区随机拍取5个视野。Image Pro Plus 6.0软件计算胶原容积分数，即CVF=心肌胶原面积/所测同视野组织总面积×100%。

1.6 免疫组织化学法测定心肌梗死边缘区微血管密度（MVD）和VEGF蛋白表达水平

心肌组织切片常规脱蜡、水化及封闭内源性过氧化物酶活性，按照羊超敏二步法免疫组化检测试剂说明书，按 1∶100 稀释，滴加一抗（CD31/VEGF），孵育过夜,依次滴加试剂 1(聚合物辅助剂)、试剂2(辣根酶标记抗山羊IgG多聚体)，DAB 显色，CD31阳性细胞表达呈棕黄色颗粒，阴性对照以PBS代替一抗。显微镜下观察左心室心肌梗死边缘区CD31阳性细胞表达情况，400倍视野下计算单位面积内CD31阳性微血管数目，在心肌梗死边缘区随机选取5个视野，取平均值，即MVD。CD31 阳性微血管计数标准：单个内皮细胞、内皮细胞簇、微小血管均予计数，带有较厚肌层区域的血管均不计数。VEGF蛋白的表达以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。采用彩色病理软件进行图像定量分析，每张切片在400倍光镜下随机选择心梗边缘区5个视野进行测量，计算出平均光密度（MOD）值，MOD值越高，蛋白表达量越多。

1.7 Western blot法检测心肌梗死边缘区VEGF蛋白的含量

提取心脏组织标本总蛋白做Western blot，采用10%聚丙烯酰胺凝胶分离目的蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后将蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后加入一抗 VEGF抗体(浓度1∶1000)，4℃孵育过夜。洗膜后，用辣根过氧化物酶标记的二抗进行杂交(浓度1：3000)，室温下孵育2 h，TBST洗膜，电化学发光（ECL）法进行化学发光显影，暗室曝光成像，用Image J分析目标条带的MOD值。以GAPDH（使用浓度1∶3000）作为内参照，比较不同处理后蛋白表达的差异。

1.8 统计学分析

应用IBM SPSS 20.0统计软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声心动图对大鼠心功能的评估（表1）

在急性心肌梗死模型建立前，超声心动图测得LVEDd、LVESd、LVEF及LVFS在各组大鼠之间无统计学差异（P＞0.05）。建模后4周后对照组大鼠心室前壁运动减弱或消失，心室收缩功能的指标LVEF、LVFS较假手术组显著降低，LVEDd及LVESd则显著升高（P＜0.01）；与对照组相比，LS组和HS组LVEF、LVFS明显升高（P＜0.01），而LVEDd及LVESd有所下降（P＜0.05），且HS组较LS组改善更明显，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 建模 4周后各组大鼠超声心动图结果（n=6,±s）

2.2 心肌组织病理改变

HE染色结果显示（图1），假手术组染色均匀，心肌排列整齐；对照组着色深浅不均匀，大量炎症细胞浸润，肌纤维排列紊乱，间隙增宽，部分肌溶灶；LS组着色深浅欠均匀，较多炎症细胞浸润，肌纤维排列不规则，少数肌溶灶；而HS组着色深浅略不均匀，较少炎症细胞浸润，肌纤维排列尚规则，极少肌溶灶。

2.3 心肌胶原改变

Masson染色显示（图1），假手术组心肌间质少许蓝色胶原沉积；对照组梗死区心肌结构基本消失，代之大片染成蓝色的胶原纤维，其间可见极少残存心肌细胞；LS组梗死区胶原纤维较对照组减少；HS组梗死区减少更明显，其间可见较多存活心肌。与假手术组比较，对照组梗死周边区胶原容积分数明显增加（P＜0.01）；与对照组比较，LS组和 HS组 CVF 均明显下降 [（（34.78±4.33）%vs（41.72±4.86）%；（29.96±3.60）% vs（41.72±4.86）%；P均＜0.01]，且HS组下降更明显[（29.96±3.60）% vs （34.78±4.33）% ，P＜0.05]。

2.4 各组大鼠心肌梗死周边区MVD的水平

在400倍光镜下计数新生血管内皮细胞CD31阳性数目。与假手术组相比，对照组、LS组、HS组大鼠心肌梗死周边区CD31阳性微血管明显增多（P＜0.01）；与对照组和假手术组相比，LS组、HS组心肌组织MVD明显增多（P＜0.01），且HS组较LS组更加明显（P＜0.01，图 2、表 2）。

2.5 各组大鼠心肌组织VEGF蛋白表达水平

免疫组化染色结果可见VEGF蛋白在心肌细胞和血管内皮细胞的胞浆均有表达，各组大鼠梗死周边区均可见VEGF蛋白表达，对照组VEGF蛋白表达虽高于假手术组，但差异无统计学意义（P＞0.05），而LS组和HS组VEGF蛋白表达水平均明显高于假手术组和对照组（P＜0.01），且HS组VEGF蛋白表达高于 LS组（P＜0.01，图 2、表 2）。

图1 各组大鼠心肌HE染色（×200）和Masson染色（×200）结果

图2 各组大鼠心肌免疫组化染色：CD31结果（×400）和VEGF结果（×400）

表2 各组大鼠心肌梗死边缘区MVD及VEGF蛋白比较（n=6,±s）

Western blot结果进一步证实，假手术组和对照组心肌组织VEGF蛋白表达量无明显差异（P＞0.05），与对照组相比，LS组和HS组VEGF蛋白表达量明显增加（P＜0.01），与LS组相比，HS组VEGF蛋白表达增加（P＜0.05，图 3）。

图3 免疫蛋白印迹法检测VEGF蛋白表达量

3 讨论

糖尿病伴冠心病的患者常表现为无痛性心肌梗死，病情严重，不易被察觉，预后更差。因此，GLP-1及其类似物作为具有心血管益处的降糖药受到广泛关注。

研究表明，GLP-1可增强自体干细胞修复缺血损伤的能力，可促进干细胞向心肌分化，减轻凋亡，促进心肌干细胞的旁分泌效应等来促进心肌梗死后的恢复，在旁分泌的生长因子中，VEGF不仅能够促进干细胞向心肌分化，还能促进毛细血管网的形成，而且VEGF的浓度与GLP-1剂量呈正比[9]。本研究也证实，利拉鲁肽可促进大鼠心肌梗死后VEGF蛋白表达及毛细血管新生，且与剂量呈一定关系。利拉鲁肽作为GLP-1受体激动剂，可通过激活GLP-1R/PI3K/Akt等通路，改善缺氧复氧引起的心肌微血管内皮细胞损伤[10]。也可降低p53和Caspase-3凋亡蛋白的表达，并促进超氧化物歧化酶的表达，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，减少心肌梗死面积[11]。糖尿病患者早期应用GLP-1类似物也可减少心血管疾病的风险因素，发挥心肌保护作用[12]，利拉鲁肽心血管结局长期评估试验（LEADER）系列研究显示，其可显著降低2型糖尿病患者的主要不良心血管事件发生率，大血管事件与微血管事件发生率以及死亡率均有降低[13,14]。但是，最新发表在JAMA上的临床研究显示，无论是否合并糖尿病，利拉鲁肽不能降低心力衰竭患者的再住院率及死亡率[15]，可能与心室早已发生不可逆性重构有关。而在心肌梗死患者经皮冠状动脉介入治疗（PCI）前即开始予利拉鲁肽治疗，可提高患者PCI后的LVEF[16]。本研究在大鼠急性心肌梗死后即予利拉鲁肽干预，也证明可改善心功能。

本研究还显示，对照组MVD及VEGF蛋白表达均高于假手术组，可能与心肌梗死后的缺血、缺氧环境能刺激VEGF合成增多，促进血管新生，重建心肌血流，但这种保护性应答通常不足以恢复生理水平的心肌灌注，而给予利拉鲁肽干预后MVD及VEGF蛋白表达明显增加，表明利拉鲁肽可能通过增加VEGF蛋白表达，促进心肌血管新生，保护心脏。而且由HE和Masson染色可见，利拉鲁肽还可能通过减少炎症反应，减轻心肌纤维化，发挥心肌保护作用，且呈剂量依赖性。

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2017-03-14）

（编辑：许菁）

Effects of Liraglutide on Angiogenesis and Myocardium Protection in Acute Myocardial Infarction Rats With its Mechanisms

LU Hui-fang, FANG Yi-jie, LI Yue, HUANG Yong-quan, LUO Li-yun, LIN Xiu-fang.

Department of Cardiology, the Fifth Aff i liated Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhuhai (519000), Guangdong, China

LIN Xiu-fang, Email: linxiufang_126@126.com

Objective: To observe the effects of liraglutide on angiogenesis and myocardium protection in acute myocardial infarction (AMI) rats with its mechanisms.

Methods: Rat’s AMI model was established by left anterior descending of coronary ligation. AMI rats were randomly divided into 3 groups: Control group, the rats received subcutaneous injection of normal saline, Low dose (LS) group and High dose (HS) group, rats received subcutaneous injection of liraglutide 70μg/(kg•d) and 140μg/(kg•d) respectively; in addition, Sham operation group, rats received normal saline. n=6 in each group, all animals were treated for 2 weeks. 4 weeks later, cardiac structure and function were assessed by echocardiography, morphological changes of myocardium were observed by HE staining, collagen volume fraction (CVF) was calculated by Masson staining, myocardial microvessel density(MVD) and protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in marginal zone of infracted region were detected by immunohistochemistry, VEGF protein level was examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Sham operation group, Control group showed decreased LVEF, LVFS and increased LVEDd,LVESd, CVF, all P＜0.01; while MVD and VEGF protein level were similar between 2 groups, P＞0.05. Compared with Control group, LS group and HS group had obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, P＜0.05,obviously decreased CVF, P＜0.01; obviously elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01. Compared with LS group, HS group presented obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, CVF, P＜0.05; elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01 or P＜0.05.

Conclusion: Liraglutide could improve angiogenesis in AMI rats which might be related to increased VEGF expression and reduced collagen deposition; therefore improve left ventricular systolic function for cardiac protection. The effect had certain relationship to liraglutide dosage.

Myocardial infarction; Angiogenesis; Liraglutide

519000 广东省珠海市，中山大学附属第五医院 心血管内科（卢慧芳、李玥、罗礼云、林岫芳），放射科（方义杰），超声科（黄涌泉）

卢慧芳 硕士研究生 主要从事心血管疾病的临床与基础研究 Email: luhf99168@163.com 通讯作者：林岫芳 Email：linxiufang_126@126.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1117-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.018

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1117.)