3 种应用于正畸支抗的金属材料的细胞毒性和遗传毒性检测

张清华 范红

3种应用于正畸支抗的金属材料的细胞毒性和遗传毒性检测

张清华 范红

目的初步评价应用于口腔正畸支抗种植体的金属材料：商业纯钛(cpTi)，钛合金(Ti6Al4V),医用316L不锈钢的生物安全性。方法参考国标GB/T16886.5-2003以及医疗行业标准YY/T0127.2-2009所规定的方法，采用体外细胞毒性实验，体外遗传毒性实验及急性全身毒性实验对3 种材料进行测试。结果cpTi、 Ti6Al4V和平316L不锈钢100%浸提液的细胞毒性分别为0 级、1 级、 2 级；DNA OTM分别为2.16±0.09， 9.84±1.78和10.79±0.39; 细胞尾部DNA分别为(0.43±0.01)%、 (0.92±0.43)%和(1.22±0.06)%。小鼠体内急性毒实验3 种材料显示毒性体征，未引起小鼠体重变化。结论cpTi生物安全性优于Ti6Al4V和316L。

商业纯钛； 钛合金； 不锈钢； 生物安全性

随着不同类型微型种植支抗钉的不断涌现，商业纯钛由于其合适的机械性能和出色的生物相容性广泛应用在种植体市场[1-2]， 然而商业纯钛(cpTi)的抗疲劳强度低于钛合金(Ti6Al4V)[3]，Ti6Al4V一直是整形外科应用较多的材料，其较纯钛具有更好的机械性能和抗腐蚀性能，并且具有比纯钛更低的弹性模量[4]。然而由于口腔环境存在腐蚀作用，Ti6Al4V释放的金属离子可能与临床上种植体失败以及一系列毒性反应有关，所以本文将对目前应用于临床的3 种正畸支抗种植体材料通过体内体外实验进行生物学安全性评价。目前，广泛应用于正畸领域的支抗种植体的材料主要有Ti6Al4V，商业纯钛，医用316L不锈钢[5],至今未见关于上述三者综合的生物安全性评价文献报道，因此，本实验的目的是通过体内和体外实验来对3 种应用于正畸支抗种植体的材料进行生物安全性评价。

1 材料与方法

1.1 材料及试样的制备

试样制备按照国家标准，将纯钛、钛合金、不锈钢(北京有色金属研究院提供)采用机械加工的方法，分别制备成直径15 mm，厚1 mm以及直径10 mm、厚度为1 mm的圆片，金相砂纸打磨至3000目，各组取10 枚钛片经过丙酮，无水乙醇，去离子水各10 min超声振荡清洗。干燥，紫外线双面照射30 min消毒备用。

1.2 材料浸提液的制备及所需试剂

按照标准CB/T16886.12中所描述的方法进行浸提液的制备。将上述消毒后的样品浸泡于含有10%小牛血清的DMEM培养基中按照3 cm2/ml比例进行浸提，置于37 ℃培养箱中静止浸提72 h，制得的浸提液按照实验需要稀释成原始浓度的50%,作为实验组，阴性对照组为10%胎牛血清的DMEM培养液，阳性对照为0.1%的苯酚。置于4 ℃冰箱备用。

1.3 细胞毒性试验

取对数生长期的人成骨样细胞MG-63用0.25%的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×103个/ml,加入96孔板进行培养，每个孔200 μl培养液，37 ℃、5%CO2培养24 h。细胞贴壁后，待细胞数目达到80%以后空白对照组用10%胎牛血清的DMEM培养液置换，实验组分别用100%，50%的浸提液置换，放入培养箱中培养，每组设6复孔。培养后的第1、3、5天各取1 块96孔板，加入CCK-8,培养1 h,检测用紫外分光光度计(Muhiscan, Thermo,美国)于450 nm波长处进行检测，计算细胞相对增殖率(relative growth rate, RGR)。

细胞相对增殖率应用以下计算公式： RGR(%)=(A sample/A control)×100%(A sample：待测样本的吸光光度值，A control：对照组的吸光光度值)

根据5 级毒性评价标准分级(cytotoxicity grade, CTG)，对各组结果进行评价(表 1)。

表 1 RGR和CTG之间的关系

1.4 遗传毒性的检测

单细胞凝胶电泳实验(SCGE)主要参考Singh等[10]所描述的方法并加以改进。

1.4.1 单细胞悬液的制备 细胞暴露于合金浸提液后，消化细胞，经1 000 r/min离心洗涤后，悬浮于预冷的PBS中，使细胞悬液的细胞密度约为1×106个/ml，同时用台盼兰染色技术细胞的存活率，以保证细胞存活率大于95%。

1.4.2 制片 取100 μl 1%正常熔点琼脂糖铺在洁净的黏附载玻片置于4 ℃冰箱中,待琼脂糖凝固,将10 μl单细胞悬液，约含1×104个细胞，与75 μl 0.65%低熔点琼脂糖混合均匀,铺于第一层琼脂糖上，置于4 ℃冰箱10 min待琼脂糖凝固。每个样本制备2 个平行样本。

1.4.3 细胞的裂解 将载玻片浸入新配置的预冷的细胞裂解液中4 ℃冰箱放置1 h。

1.4.4 电泳 取出载玻片，在蒸馏水中漂洗3 次，去除残留的细胞消化液，放置于水平电泳槽中，加入新配置的电泳缓冲溶液(pH=13)避光作用20 min，使DNA解旋，在300 mA、20 V条件下电泳20 min(1 V/cm)。

1.4.5 中和染色 用预冷的Tris中和缓冲液浸洗3 次，每次晾干，用溴化乙锭EB(20 μl，25 mg/L)染色，再盖上盖玻片，放置于荧光显微镜下读片。

所有步骤黄光下进行，避免额外的DNA损伤。

1.4.6 读片分析 400 倍荧光显微镜(OLYMPUS-BX51)下观察(荧光激发波长为590 nm),数码相机(OLYMPUS-DP50)拍摄，每个样本取200 个细胞，使用CASP软件分析细胞尾部DNA百分含量(percentage of DNA in the tail,%tail DNA)和Olive尾相(olive tail moment,OTM)作为DNA损伤的指标。

1.5 急性全身毒性实验

1.5.1 实验动物 健康成年白化小白鼠35 只，体重150～280 g(山西医科大学实验动物中心)，根据实验材料随机分成7 组(n=5)。

1.5.2 实验方法 按照标准ISO 10993-11,2006所描述的全身毒性试验方法进行(表 2)。

表 2 急性全身毒性分级

2 结 果

2.1 细胞毒性试验

第1天实验组及阴性对照组细胞贴壁，随着时间的增加，DMEM对照组，纯钛组，钛合金组观察到镜下观察细胞充分伸展，呈长梭形，胞质饱满。316L不锈钢组细胞贴壁不完全，视野下细胞数量少(图 1)。采用CCK-8法检测各组金属浸提液是否具有细胞毒性，分别应用试剂盒培养1、3、5 d检测细胞毒性，结果显示不锈钢组3 d和5 d与对照组DMEM组相比吸光度值较低，且具有统计学意义。纯钛组细胞毒性级别为0 级，合金组毒性均为1 级，在第5天时不锈钢组细胞毒性为2 级，参考表 1纯钛和钛合金组无毒性，不锈钢组具有轻度细胞毒性(表 3)。

A: 对照组； B: cpTi组; C: Ti6Al4V组; D: 316 L不锈钢组

图 1 细胞一般形态观察(×400)

A: Control group; B: cpTi group; C: Ti6Al4V group; D: 316L stainless steel group

Fig 1 Cell morphology observed by optical microscope(×400)

Tab 3 The absorbance value and RGR of MG-63 cells and the cytotoxicity grade of the samples (n=6，±s，%)

注： ①Plt;0.05, 与空白组相比较

2.2 遗传毒性试验

彗星实验结果显示，阳性苯酚组及316L不锈钢组均有彗尾，纯钛组，阴性对照组及钛合金组均未见明显彗尾(图 2)。表 4中结果显示，316L不锈钢浸提液组的尾部DNA百分量高于阴性对照组，但低于阳性对照组，差异均具有显著性，由此说明316L不锈钢组具有轻微的遗传毒性。

2.3 急性全身毒性实验结果比较

经观察各组实验动物的一般状态，肉眼观察未见明显的毒性表现，动物活跃，反应敏捷，毛色光亮，进食正常，无动物死亡显像，但各组动物的体重变化显示不同实验组对小鼠的体重无一定的影响(表 5)。

A： cpTi组； B： 阳性苯酚组； C： 316L不锈钢组； D： 空白对照组； E： Ti6Al4V组

图 2 单细胞凝胶电泳(彗星)实验(×400)

A： cpTi； B： Phenol； C： 316L stainless steel； D： Blank； E： Ti6Al4V

Fig 2 Single-cell gel(comet) assay(×400)

Tab 4 Olive tail moment and percentage of DNA in the OTM tail of the different extracts (n=3, ±s)

注： OTM(Olive tail moment)： 尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积； %tail DNA: 尾部DNA百分量，尾部和总彗星荧光百分比

表 5 小鼠实验前后体重(g,n=5)

Tab 5 Weights of the mice before and after test (g, n=5)

3 讨 论

不同材料组成的正畸材料将会在口腔环境中释放不同的金属离子[6]，材料的这种性能可能与其生物安全性有关，这种生物安全性是一种相对的、实用意义上的安全概念，指在一定接触水平下，其伴随的毒性很低或其危险程度在人们能接受的范围内。种植体失败的原因很多，已经有大量文献对其进行了报道，因此种植体材料组成是否与种植体失败有关还具有争论。

3.1 细胞毒性实验

研究生物材料的细胞毒性及对成骨细胞形态、黏附能力的影响是检测生物材料相容性的重要指标[7-8]。细胞培养技术作为一种快速，简便，重复性好的方法，广泛应用于生物安全性评价试验中，目前很多方法应用于检测细胞毒性，其中CCK-8法可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析[9]。因CCK-8法具有简单易操作灵敏度高等优点，本实验采用此法对3 种金属的细胞毒性进行评价。 骨肉瘤细胞系MG-63被广泛应用于医学材料以及药物研究中[10-11]。本实验中选择了人成骨细胞系MG-63作为实验对象。本实验制作3 种金属的浸提液，按照100%、50%的浓度进行细胞培养，同时以添加血清的高糖DMEM细胞培养液作为阴性对照组。各个样本的细胞相对增殖率可通过公式得出。从检测结果看，纯钛浸提液组和阴性对照组对细胞的毒性为0 级，两者之间无统计学差异(Pgt;0.05)，各个样本的细胞相对增殖率可通过公式得出。从时间点的检测结果和计算所得的RGR得到纯钛组细胞毒性等级为0 级，随着时间增长，细胞的相对增殖率升高。不锈钢组随时间增长细胞的增殖率增长不明显，第5天有降低的趋势，计算所得第5天100%不锈钢浸提液对细胞毒性等级为2级，表明对细胞有轻微毒性,钛合金组结果表明随着时间的增长，细胞增殖率升高，但其相对增殖率结果显示其细胞毒性为1 级，对细胞无毒，但细胞活性低于纯钛和阴性组，这可能和钛合金浸提液中析出的Al离子和V离子的浓度有关[12-13]。以上结果说明316L不锈钢具有轻微的细胞毒性，而纯钛及钛合金对细胞无毒性，其中纯钛的生物相容性较好。这一结果为临床选择支抗种植体的材料提供了参考，应尽量选择无细胞毒性的材料。

3.2 遗传毒性实验

正畸支抗钉的遗传毒性研究少见报道， Piozzi等[14]将纯钛的微种植体植入大鼠的胫骨内，分别于30、60、180 d取大鼠的肾脏，肝脏，肺脏组织，对其进行组织学分析以及遗传毒理学研究，得出结论纯钛微种植体不会引起大鼠组织学改变以及DNA的损伤，为Ni-Ti合金、商业纯钛和316L不锈钢的遗传毒性通过电子显微镜原位末端标记法(EM-ISEL)对不同试样制备的浸提液引起的外周血淋细胞DNA损伤进行检测，实验结果显示Ni-Ti合金和商业纯钛无遗传毒性，而316L不锈钢有遗传毒性。应用彗星实验进行遗传毒性评价具有操作简便，精确度高可以从分子水平对遗传毒性进行分析，明显优于微核试验，染色体畸变实验[14]。本实验通过检测3 种金属浸提液对MG-63细胞的DNA损伤来评价其遗传毒性，从图中可见过氧化氢阳性组有较为明显的彗尾，通过比较尾部DNA含量(%tail DNA)与尾相(OTM)与阴性对照组比较[15]，纯钛浸提液组，钛合金组与阴性对照组相比无明显差别(Pgt;0.05)，而从实验数据可以看出，316L不锈钢浸提液组尾部DNA百分量明显高于阴性对照组，但低于阳性对照组，说明其对细胞的DNA具有一定的损伤，由此我们可以推断316L不锈钢组具有轻微的遗传毒性。

3.3 急性全身毒性实验

本实验根据YY/T0127口腔行业标准对3 种材料进行急性全身毒性评价，采用静脉注射途径给药，阴性对照组及实验组小鼠均未见死亡及毒性反应，3 种金属浸提液注射的小鼠其体重前后变化进行比较分析，通过统计学分析注射前后体重无明显差异(Pgt;0.05)。

对生物材料的生物相容和遗传毒性的研究与评价，不仅要从整体水平去观察材料对生物体的影响，从细胞水平去观察对细胞形态和生长能力的影响，还要深入到分子水平从DNA的改变来评价这种生物材料的生物相容性，本实验综合体内体外实验，通过细胞水平和分子水平观察，系统的评价了3 种应用于正畸支抗种植体领域的金属材料的生物安全性，为临床应用提供了科学依据。

4 结 论

本实验得出316L不锈钢具有轻微的细胞毒性及遗传毒性，而纯钛和钛合金的生物相容性好，体内体外实验检测均无毒，为以后这3 种金属的临床应用提供参考。

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(收稿： 2016-09-23 修回： 2016-12-08)

Comparisonofthebiologicalsafetyofthreemetaldentalmaterials

ZHANGQinghua,FANHong.

030012Taiyuan,ShanxiProvincialPeople'sHospital,China

Objective: To evaluate the biological safety of commercial pure Ti(cpTi), Ti alloy Ti6Al4V and stainless steel 316L.MethodsAccording to the GB/T16886.5-2003 and YY/T0127.2-2009 standards, the extraction of the 3 materials was respectively prepared, cck-8 assay was used to test their cytotoxicity，single cell gel electrophoresis was used to test their genotoxicity，andinvivotest was used to test their acute systemic toxicity.ResultsThe cytotoxicity of 100% extractions of 316L, Ti6Al4V and cpTi was graded to 2, 1 and 0, the olive tal moment(OTM) 10.79±0.39, 9.84±1.78 and 0.92±1.43, the percentage of tail DNA (1.22±0.06)%, (0.92±0.43)% and (0.43±0.01)% respectively. No systemic toxicity and no body weight change was observed in the acute systemic toxicity test in mice.ConclusioncpTi has better biologic safety than Ti6Al4V and 316L.

PureTi;Tialloy;Stainlesssteel;Biologicalsafety

030012 太原， 山西省人民医院

张清华 E-mail: 861828704@qq.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.008