HMGB1相关基因多态性对中国汉族乳腺癌患者无病生存期和总生存期的影响

傅春燕++程雪　潘颖　陈述政　徐民

[摘要] 目的 研究中國汉族女性乳腺癌患者高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）相关基因遗传变异与无病生存期（DFS）和总生存期（OS）之间的关系。 方法 回顾性分析2010年5月～2015年10月期间我院收治的420例乳腺癌患者的临床资料，分析8个基因的166个单核苷酸多态性（SNPs），并采用多变量Cox比例风险模型来估计SNPs的风险比和95%置信区间（CI），在多基因风险评分的累积水平评估SNPs对乳腺癌预后的影响。 结果 与DFS显著相关的SNPs是MMP2基因的单核苷酸多态性，分别为rs243867位点（HR为1.28，95%CI为1.02～1.52，P<0.05）和rs243842位点（HR为1.25，95%CI为1.04～1.55，P<0.05）。而与OS相关的SNPs为MMP2基因的rs243842位点（HR为1.35，95%CI=1.01～1.74，P<0.05）、HMGB1基因的rs4145277位点（HR为1.31，95%CI=1.01～1.68，P<0.05）、TLR2基因的rs7656411位点（HR为0.78，95%CI，0.58～0.99，P<0.05）和TLR4基因的rs7045953位点（HR为0.51，95%CI=0.27～0.88，P<0.05）。DFS和OS患者的多基因风险评分结果显示，其第三个三分位数风险比率分别为1.79（95%CI=1.29～2.41）和2.84（95%CI=1.84～4.51）。 结论 HMGB1相关基因的遗传多态性与乳腺癌患者的预后有关。

[关键词] 高迁移率族蛋白B1；乳腺癌；无病生存期；总生存期；基因多态性

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）29-0001-05

Effects of HMGB1-related gene polymorphisms on disease-free survival and overall survival in Chinese Han patients with breast cancer

FU Chunyan CHENG Xue PAN Ying CHEN Shuzheng XU Min

Department of Breast and Thyroid Surgery， Lishui Central Hospital in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To study the relationship between genetic variation of high mobility group box 1 （HMGB1）-related genes and disease free survival（DFS） and total survival（OS） in Chinese Han women with breast cancer. Methods The clinical data of 420 patients with breast cancer who were admitted to our hospital from May 2010 to October 2015 were retrospectively analyzed. 166 single nucleotide polymorphisms（SNPs） of 8 genes were analyzed， and the multivariate Cox proportional hazards model was used to estimate the risk ratio of SNPs and 95% confidence interval（CI）. The effect of SNPs on the prognosis of breast cancer was assessed at the cumulative level of polygenic risk score. Results SNPs significantly associated with DFS were single nucleotide polymorphisms of the MMP2 gene， which were locus rs243867 （HR 1.28， 95%CI 1.02-1.52， P<0.05） and locus rs243842（HR 1.25， 95%CI 1.04-1.55， P<0.05）. SNPs associated with OS were locus rs243842 of the MMP2 gene（HR=1.35， 95%CI=1.01-1.74， P<0.05）， locus rs 4145277 of HMGB1 gene（HR=1.31， 95% CI=1.01-1.68， P<0.05）， locus rs7656411 of TLR2 gene （HR 0.78， 95%CI 0.58-0.99， P<0.05） and locus rs7045953 of the TLR4 gene（HR 0.51， 95%CI=0.27-0.88， P<0.05）. The results of polygenic risk score for DFS and OS patients showed a third tertile risk ratio was 1.79 （95%CI=1.29-2.41） and 2.84 （95%CI=1.84-4.51）. Conclusion The genetic polymorphism of HMGB1-related gene is related to the prognosis of breast cancer patients.endprint

[Key words] High mobility group box 1（HMGB1）； Breast cancer； Disease free survival； Total survival； Gene polymorphisms

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占女性所有癌症的25.5%[1]。研究显示，乳腺癌的发生和发展是由环境因素和遗传因素所共同决定的，鉴定与乳腺癌发生和转移相关的遗传因素对于乳腺癌的治疗具有非常重要的临床意义[2]。HMGB1蛋白参与DNA翻译和复制，其也在细胞凋亡和免疫应答中起重要作用[3-5]，因为可以作为晚期糖基化终产物（RAGE）[6]、各种Toll样受体[7]（Toll-like receptors，TLR2，TLR4和TLR9）的配体以及骨髓细胞上表达的触发受体1[8]。有Meta分析研究RAGE在不同类型癌症风险的相关性，但是缺少对HMGB1 的研究[9，10]。最近有学者对中国汉族人群HMGB1/RAGE通路的研究表明，RAGE基因多态性与乳腺癌风险之间存在显著的相关性[11]。然而，关于HMGB1及其相关基因对乳腺癌预后的影响的研究很少。随着乳腺癌发病率的增加，研究HMGB1及其相关基因对乳腺癌预后的影响至关重要。本研究的主要目的是分析HMGB1及其相关基因单核苷酸多态性（SNPs）对乳腺癌预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2010年5月～2015年10月期间我院收治的420例乳腺癌患者的临床资料，收集患者临床资料，包括患者的年龄、学历、绝经期、绝经年龄、生育史、子女数量、身体质量指数（BMI）、TNM分期、是否进行了化疗、是否进行激素治疗和放疗、组织学分级、雌激素受体阳性和阴性、孕激素受体阳性和阴性以及乳腺癌家族史等。排除以下几类患者：①临床资料不全的乳腺癌患者（n=8）；②有乳腺癌或其他癌症史（n=4）；③有其他良性乳腺疾病的患者（n=3）。对于生存分析，排除失访的患者（n=15），本研究初次纳入450例患者，排除不合格的患者后纳入420例。

1.2 方法

无病生存期（DFS）的计算是从乳腺癌患者手术之日到复发日期，包括局部和远处转移、死亡或最后随访观察日期。总体生存期（OS）是从诊断乳腺癌直到最后随访观察日期或患者死亡日期。本研究中的420例患者中，有51例患者出现DFS事件，28例患者出现OS事件。

取受试者肘静脉血5 mL后抽提基因组DNA并对HMGB1及其相关基因进行分型，将抽提的基因组DNA送至上海桑尼生物科技有限公司测序。参考有关文献资料[12]，选择HMGB1基因和其5个结合受体基因作为本研究的候选基因。此外，根据研究显示，基质金属蛋白酶2（MMP2）和MMP9在HMGB1/RAGE途径中发挥了一定的作用[13，14]，因此也将其纳入本研究，本研究中包含8个基因共160个SNP，序列范围包含第一个转录位置上游的20 kb以及最后一个外显子下游的20 kb，结合测序结果并结合有关文献确定本研究中各SNP的具体位置[15]。

1.3 统计学分析

本研究中数据的统计学分析采用SPSS20.0软件，用对数秩检验和多因素Cox比例风险模型评估DFS和OS组的基线资料。对与DFS和OS两者相关性显著的因素进行多因素Cox比例风险模型的调整。采用Logistic回归模型估计每个SNP的乳腺癌风险比（HR）和95%置信区间（CI）。在分析中使用了加性、共显性和显性模型。通过评估多基因风险评分，在累积水平评估SNP对乳腺癌预后的影响。多基因风险评分模型的建立参考Reeves GK等研究[16]。本研究的420例患者中，51例患者纳入DFS模型分析，28例患者在OS模型分析中。经多因素风险评分分类后，患者分为三分位数。通过使用多元Cox比例风险模型，基于第1个三分位数计算第2个三分位数和第3个三分位数的危险比（HR）和95%CI，其具有最低的多基因风险评分作为参考值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般病理特征

DFS组的随时间的中位数为3.85年（2.91～4.94年），OS组的随时间的中位数为3.91年（3.01～4.97年）。结果显示，两组中TNM分期、ER状态、PR状态、辅助化疗、辅助激素治疗、组织学分级与乳腺癌预后显著相关，而年龄、教育水平、乳腺癌家族史、BMI、绝经状态、绝经年龄、生育史、子女数量和辅助放疗等与乳腺癌预后没有相关性，见表1。

2.2 HMGB1相关基因中的单核苷酸多态性

在DFS患者中最重要的SNP为MMP2基因的单核苷酸多态性，其位点分别为rs243867（HR为1.28， 95%CI为1.02～1.52，P<0.05）和rs243842（HR为1.25， 95%CI为1.04～1.55，P<0.05）；而在OS组患者中最重要的SNP为MMP2基因的rs243842（HR为1.35，95%CI=1.01～1.74，P<0.05），HMGB1基因的rs4145277位点（HR为1.31，95%CI=1.01～1.68，P<0.05）及TLR2基因的rs7656411位点（HR为0.78，95%CI，0.58～0.99，P<0.05）和TLR4基因的rs7045953位點（HR为0.51， 95%CI=0.27～0.88，P<0.05）。另外，用共显性模型评估SNP与乳腺癌预后的关系，结果显示出与加性模型的趋势一致，见表2、表3。

2.3 多基因评分与乳腺癌预后的关系

DFS事件组的多基因风险评分分析显示，与第一个三分位数的参考值相比，第三个三分位数的风险比为1.79（95%CI=1.29～2.41）。在OS事件组中，与第一个三分位数的参考值相比，第三个三分位数的风险比为2.84（95%CI=1.84～4.51），见表4。endprint

3 討论

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国乳腺癌的发病率和死亡率呈年轻化趋势。随着研究的深入，对乳腺癌有了进一步的认识，目前认为乳腺癌的发生和发展是有多因素共同作用的结果。本研究的结果表明，MMP2基因的SNP rs243842与DFS或OS患者的乳腺癌预后一致。在DFS患者中，MMP2基因rs243842位点和rs243867位点与乳腺癌预后差异有统计学意义（P<0.05），而在出现OS事件患者中，MMP2基因rs243842位点和HMGB1基因的rs4145277位点与乳腺癌预后差异显著（P<0.05）。相比之下，TLR2基因中的rs7656411位点和TLR4基因中的rs7045953位点与出现OS事件的患者的良好预后相关性显著（P<0.05）。此外，对HMGB1相关基因遗传多态性的多基因风险评分模型分析的结果显示，出现DFS和OS事件患者的危险比与相关风险等位基因的数目呈正比。

HMGB1蛋白是一种损伤相关的分子模式分子，在炎症反应中发挥重要作用[17]。研究显示[18]，HMGB1通过与三种重要受体[分别为晚期糖基化终产物（RAGE）和Toll样受体TLR2和 TLR4]的相互作用来转导其信号。HMGB1诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α，激活NF-κB，这些作用通过加速细胞增殖和抑制细胞凋亡来促进肿瘤生长[19]。除HMGB1外，恶性间皮瘤细胞也表达高水平的TLR2和TLR4，这表明HMGB1/TLR通路可能影响肿瘤生长和转移[18]。通过这些相关研究中关于HMGB1相关基因功能并结合本研究结果，推断rs4145277位点HMGB1表达增加与乳腺癌预后较差有关。此外，rs7656411位点和rs7045953位点多态性可能降低与HMGB1结合的TLR2和TLR4的表达水平，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，与乳腺癌患者预后良好相关。

在乳腺癌的发生和发展过程中，基质金属蛋白酶2（MMP2）也起着非常重要的作用，MMP2能够降解乳腺癌中的基质，不仅能使基质的结构和生化特性发生改变，同时影响基质细胞的增生和分化。本研究结果显示，MMP2基因中rs243842位点SNP在DFS组和OS组中与乳腺癌预后显著相关，而rs243867仅与DFS组乳腺癌预后相关。有研究者对体内和体外模型进行研究时，结果显示癌细胞中HMGB1/RAGE水平升高[12]。另外，阻断RAGE后MMP2活性受到抑制，细胞外基质分子的分解明显减少[13]。因此，HMGB1/RAGE复合物通过促进细胞侵袭作用促进癌细胞的生长和转移。此外，有研究显示人血清MMP2水平与乳腺癌预后相关[20]。由此可以看出，受到rs243842和rs243867等遗传因素的影响导致MMP2被激活，使乳腺癌患者预后较差。然而本研究选择的是基于高加索人群数据选择的标记SNP，因为缺少针对我国汉族人群的相关SNP研究。但是，本研究将HMGB1和HMGB1相关基因纳入研究，这两个基因在癌症的发生中起非常重要作用。另外，本研究的样本量也较小，需要进一步进行大样本量验证。

综上所述，HMGB1、TLR2、TLR4和MMP2基因与乳腺癌的预后有显著相关性。

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（收稿日期：2017-07-18）endprint