一例羊源肺炎克雷伯菌和大肠杆菌混合感染的诊断

费中杰 扬州大学兽医学院 225001

一例羊源肺炎克雷伯菌和大肠杆菌混合感染的诊断

费中杰 扬州大学兽医学院 225001

2016年11月，泰州市某畜主送2只病羊到扬州某动物医院就诊。病羊主要表现为精神沉郁、眼睛红肿、咳嗽。从病羊中分离出一株肺炎克雷伯菌和一株大肠杆菌。药敏试验结果表明，两种菌株对诺氟沙星和氧氟沙星等药物高敏，对青霉素和红霉素等药物耐药。根据药敏试验结果及时调整用药方案，从而使病情迅速得到控制。

羊；肺炎克雷伯菌；大肠杆菌

肺炎克雷伯菌广泛分布于动物的呼吸道和消化道中，是一种条件致病菌。该菌在韩国、欧洲和非洲等地都有报道，并呈现增多的趋势[1]。近年来由于抗生素的滥用，导致肺炎克雷伯菌的耐药性普遍存在，给治疗带来困难[2]。本研究从病死湖羊的组织中分离培养出一株肺炎克雷伯菌和一株大肠杆菌，通过实验室诊断和药敏试验，为病羊的诊断与治疗提供依据。

1 材料

（1）病料来源。泰州某养殖场2只湖羊。

（2）主要试剂。血平板培养基、麦康凯琼脂培养基、肠杆菌科细菌生化鉴定管 （杭州微生物）、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（宝生物工程有限公司）和大肠杆菌诊断血清（杭州微生物）等。

2 方法

（1）剖检病变。剖检可见肺淤血、坏死，心外膜增厚，肝脏肿大、坏死，肠道出血，其他组织器官无特征病变。

（2）细菌分离培养。用接种环挑取病变脏器内部组织，在麦康凯平板划线，放入37°C恒温箱中培养18小时，观察结果。

（3）革兰氏染色鉴定。挑取疑似菌落进行固定，滴加结晶紫初染1分钟、碘液1分钟、乙醇脱色0.5分钟、沙黄水溶液复染30秒，吸干，镜检[3]。

（4）生化试验。菌株1和菌株2均属于肠杆菌科，用肠杆菌科细菌生化鉴定管鉴定。

（5）血清型鉴定。将菌株1和菌株2用大肠杆菌诊断血清做玻板凝集试验进行鉴定。

（6）16S rRNA基因序列测定。将纯化好的菌液煮沸法提取DNA作为PCR模板，用16SrDNA Bacterial PCR Kit试剂盒中的通用引物进行扩增。将扩增产物送去金斯瑞公司进行测序，测序结果在NCBI数据库进行BLAST分析。

（7）药敏试验。取纯化好的菌液灭菌棉签在LB培养基上涂抹均匀，再用灭菌镊子将药敏纸片贴于培养基上。然后将培养基置于37℃培养箱中，经18～24小时用尺测量抑菌圈直径。

3 结果

（1）细菌形态。分别挑取单菌落进行纯化培养，分离到2种菌株。菌株1在麦康凯培养基上形成圆形隆起、光滑、湿润、边缘整齐、偏大的红色菌落，在血培养基上形成圆形隆起、光滑、湿润、较大的灰白色菌落。菌株2与菌株1相似，颜色偏淡，形态较小。

（2）革兰氏染色结果。菌株1在光学显微镜下可以观察到粉红色的直杆菌，菌体较大，两端钝圆，散在或成对。菌株2与1相似，形态较小。

（3）生化试验结果。菌株1对照伯杰氏细菌手册，鉴定结果该菌株为大肠杆菌。菌株2鉴定结果该菌株为肺炎克雷伯菌（见表1）。生化特性与杨红军等研究一致[4]。

表1 生化试验结果

（4）血清型鉴定结果。将菌株1和菌株2分别进行血清型鉴定，通过大肠杆菌诊断血清，玻板凝集试验确定菌株1是大肠杆菌，血清型是020。

（5）16S rDNA序列测定。菌株2PCR扩增的产物条带为1800bp（见图1）。序列与肺炎克雷伯菌的序列同源性达到99%以上（见图1）。

图1 1%琼脂糖凝胶电泳图

图2 序列比对图

（6）药敏试验结果。菌珠1和2分别选用24种药物做药敏试验。结果表明大肠杆菌对头孢唑啉等13种药物高敏，对头孢氨苄等4种药物中敏，对苯唑西林等7种药物耐药；肺炎克雷伯菌对头孢唑啉等8种药物高敏，头孢氨苄等4种药物中敏，对红霉素等12种药物耐药（见表2）。

表2 药敏试验结果（单位：mm）

4 小结与讨论

（1）肺炎克雷伯菌是羊肠道中的一种常在菌，在饲养管理不善的养殖场，肺炎克雷伯菌病经常发生，从而给养殖场造成严重的经济损失。

（2）在观察疑似菌落时注意大肠杆菌，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的颜色、形态相似，而且少数大肠杆菌对羊具有致病性。通过血清型鉴定，分离出大肠杆菌的血清型是020，结合相关文献研究，确定血清型020对羊没有致病性[5]，从而确认肺炎克雷伯菌是致病菌，需要开展动物试验进一步确认。

（3）药敏实验结果显示，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均对喹诺酮类药物高敏，用诺氟沙星对羊群进行预防治疗，使疫情得到了控制。在临床用药过程中，我们应当选择敏感性高的药物治疗。

[1]Shon AS，Bajwa RP，Russo TA， Hypervirulent（hypermucoiscous）Klebsiella pneumoniae：a new and dangerous breed.[J]Virulence.2013，4（2）：107-118.肺炎克雷伯菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志，2012，48（2）:1-2.

[2]张智，李再新，曾光菊，李丙超，胡卫东，赵志平，刘章琴，陈欲云.一株兔源耐药性肺炎克雷伯菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2013，40（9）:1-5.

[3]李超，王玉英，王冬冬，范丹丹，王平，纪鸿翔，尹燕博.引起幼貂大量死亡的肺炎克雷伯菌的分离和鉴定 [J].中国兽医杂志，2015，11（51）:1-4.

[4]杨红军，陈海华，孙凤青，王豪举，彭远义，张建明.鸡肺炎克雷伯菌的分离鉴定[J].中国兽医杂志.2009，7（45）:1-2.

[5]黄青云.畜牧微生物学[M].北京：中国农业出版社，2009，5:220-221.