心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶荧光检测方法的建立

褚春旭，孙雪，丁秋雨，李超，于源华

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶荧光检测方法的建立

褚春旭，孙雪，丁秋雨，李超，于源华

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MB）是早期诊断急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的重要标志物，该研究以荧光微球为标记物研究快速、灵敏的CK-MB荧光免疫层析检测方法。通过N-羟基琥珀酰（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）将荧光微球与市售的抗体共价偶联，优化抗体与荧光微球的偶联条件，对偶联获得的抗体荧光标记物进行表征，制备了CK-MB的荧光免疫层析检测卡，建立了CK-MB荧光免疫层析检测方法。荧光微球偶联率91.7%，CK-MB检测卡定量检测线性范围为1ng/ml～1000ng/ml，灵敏度达到了1ng/ml，CV值＜8%，回收率84%～108.3%。利用间接ELISA法对市售抗体进行筛选，获得了包被抗体以及标记抗体，建立了心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶荧光检测方法，实现血清中CK-MB定性与定量检测，为心肌损伤标志物荧光免疫层析检测方法的研发提供了实验技术基础。

心肌损伤标志物；肌酸激酶同工酶；荧光微球；荧光免疫分析法

近年来，由于心肌损伤引起的疾病已经严重的威胁到了人类生命与健康［1］。心肌损伤标志物CK-MB又称血清肌酸激酶同工酶，是人体细胞内能量的代谢有关的具有重要作用的酶［2］。CK和CK-MB在监测鉴别诊断心肌梗死患者中起重要作用，CK-MB在适当的临床环境中的非典型的上升和下降现象足以证实AMI是否发生［3］，在急性症状入院后4至8小时内，血清总CK和血清CK-MB接近其各自的峰值活动。当胸痛发作时，CK-MB较早出现在血液中，据此特点CK-MB可以作为早期诊断AMI的标志物［4-5］，同时也可用于检测心肌梗死的面积以及判断是否再梗死［6］。

检测CK-MB的方法有很多，如酶活力测定法、酶联免疫（ELISA）定量检测方法［7］、化学发光免疫分析检测法以及床旁快速检测（POCT）免疫层析检测法等。酶活力测定法灵敏性不高［8］，ELISA检测时间长，化学发光法检测CK-MB具有特异性强以及灵敏度高的特点将逐渐取代免疫抑制法以及放射性免疫分析法［8-9］，POCT试剂检测方法操作简单，检测时间短且不需要大型的分析检测仪器，实现了实时现场快速检测。目前常用的POCT检测方法中包含胶体金免疫层析检测法以及量子点、荧光微球等荧光免疫层析检测法等。胶体金免疫层析可定性或半定量进行检测，而荧光免疫层析可实现CK-MB的定量检测。

图1 试纸条原理图

荧光免疫层析试纸条或检测卡由吸水纸、NC膜、释放垫、样品垫分别按顺序粘在PVC板上，通过裁剪可为试纸条，如图1所示。荧光微球有微球粒径均一、形态结构稳定、实验重复性好、发光效率高、单分散性好等特点，并具有环境变化影响小，生物相容性好等优点［11-12］。该研究以荧光微球为标记物，以anti-CK-MB 7502作为标记抗体，利用EDC与NHS作为活化剂来活化微球，促进其与抗体的共价偶联。对缓冲液的pH值、共价偶联时间与温度等条件对偶联结果的影响做了详尽探讨，并研制荧光免疫层析检测卡，其操作简单，12min即可获得检测结果，灵敏度较高，线性范围较宽，可实现血清中CK-MB定性与定量检测［13］。对临床医学快速检测技术的发展具有重要意义［14］。

1 材料与方法

其中，OD0为测量偶联前的IgG溶液吸光值；OD1为将偶联后的抗体与微球复合物进行离心后上清的OD值；OD2为再将复合物利用缓冲液PB进行清洗，离心后的上清OD值。

设计实验如表1，按下表所示的条件同时做9组实验，进行蛋白偶联最佳条件的摸索。

1.1 材料与仪器

肌酸激酶同工酶（CK-MB）、CK-MB单克隆抗体anti-CK-MB 7501及anti-CK-MB7502（Medix，芬兰）、羊抗鼠IgG（上海生工生物工程有限公司，中国）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sigma，美国）、荧光微球（Huge，中国）。

小型高速离心机Centrifuge 5427 R（Eppendorf，德国）；荧光免疫层析检测仪（上海捷宁生物科技有限公司，中国）；三维平面点膜仪（上海金标生物科技有限公司，中国）。

1.2 量子点与抗体偶联最佳条件的研究

1.2.1 包被抗体与标记抗体的筛选

将CK-MB抗原配制成2μg/mL每孔100μL，37℃恒温包被1h；清洗3min，重复3次；CK-MB抗体按 1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000的比例稀释，每孔100μL，每个浓度做三个重复，37℃孵育1h；洗涤3次，每孔加入100μL HRP-羊抗鼠多抗（1∶3000稀释），37℃孵育1h；洗涤3次后，加入100μL的TMB应用液反应20min；使用酶标仪测定波长450nm处的吸光度，计算获得抗体效价。

1.2.2 荧光微球与CK-MB单克隆抗体供价偶联及条件优化

取10μL的微球用100μL的MES（pH6.0）清洗两次后重悬超声；分别取出10μL的0.001M EDC及0.001M NHS加入到清洗后的微球溶液中进行活化；清洗两次后用PB缓冲液进行重悬超声；按微球与抗体比为10∶1到5∶1的比例加入抗体蛋白，进行偶联；离心留取上清检测偶联率，清洗两次并重悬超声后放入4℃备用。

测定偶联效率的方法是通过检测偶联前和偶联后的抗体浓度变化进行偶联效率的计算，

表1 不同条件偶联率测定

1.2.3 荧光微球与抗体偶联表征

将10μL的荧光微球用100μL的MES（pH6.0）缓冲液反复清洗2次；用MES（pH6.0）缓冲液重悬超声；留一管放入4℃备用，另一管加入相同比例的1M的EDC与NHS各10μL，室温活化1.5h；反复清洗两次后，用PB缓冲溶液进行重悬超声，加入32.5μg/mL的IgG，25℃偶联1h。离心后，吸出液体，用PB缓冲溶液进行重悬超声，反复清洗2次。将两管样品用扫描电子显微镜检测分析。

1.3 荧光免疫层析检测卡制备

利用三维平面点膜仪进行层析卡试剂包被，质控线为羊抗鼠多抗，包被浓度1.5mg/mL，检测线为anti-CK-MB 7501单克隆抗体，包被浓度为1.25mg/mL，包被完成后放入37℃烘箱干燥2h备用。将吸水纸，NC膜，样品垫及释放垫依次贴于PVC板上，裁剪宽度4mm，放入密封袋中防潮备用。

1.3.1 检测时间的确定

组装试剂卡，每个试剂卡中加入标准品（200ng/ml），利用荧光定量检测仪每隔2min进行一次检测，记录T/C比值，T为检测线，C为质控线。由于标记抗体与包被抗体的量为定值，在层析完成后T线与C线荧光强度也为定值，所以当T/C值趋于固定值时所记录的时间即为检测时间。

1.3.2 标准曲线的建立

采用磷酸盐缓冲液（PBS）将CK-MB标准品分别稀释为 0ng/mL，1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL，每组浓度5个重复，采用制备的荧光免疫检测卡检测CK-MB标准品，荧光免疫层析检测仪检测荧光强度，建立不同浓度CK-MB标准品与荧光强度的线性关系，确定CK-MB定量检测灵敏度。

1.3.3 CK-MB试纸条重复性研究

在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，加入CK-MB标准品浓度为每毫升25.0、125.0、625.0ng进行检测，每个浓度样品重复检测三次，检测结果计算出检测CV值大小。选用不同批次的检测卡中，进行相同条件的检测计算回收率，同时计算其批内差和批间差对检测卡的重复性和稳定性进行评价。

1.3.4 CK-MB检测方法学比较及相关性测定

通过对市售的胶体金试剂卡的检测方法进行比较，通过利用检出抗原浓度做对比。同时将CK-MB标准品按浓度为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL加入到胶体金检测卡及CK-MB免疫层析检测卡进行检测，每个浓度做3组重复实验，判断其检测相关性。

1.3.5 CK-MB免疫层析试纸条稳定性的研究

研究根据阿伦尼乌斯经验式，37℃加速热稳定性考察模拟试剂的稳定性。将CK-MB免疫层析试纸条在37℃下密封放置7天，使用仪器来检测并研究试纸条的T线与C线的显色情况以及灵敏度在第3天和第7天2个时间点来考察试纸条的稳定性性。

2 结果与讨论

2.1 包被抗体与标记抗体的确定

通过使用酶标仪测定波长450nm处的OD值检测，CK-MB两种抗的效价如图2，图3所示。

图2 anti-CK-MB 7501效价分析

图3 anti-CK-MB 7502效价分析

最终检测结果表明抗体效价anti-CK-MB 7501抗体的效价高于anti-CK-MB 7502抗体的效价，即亲和性7501＞7502；由于包被抗体为固定相，所以选择亲和性更好的抗体作为包被用于捕获抗原，则将anti-CK-MB 7501作为包被抗体，用于捕获抗原；将anti-CK-MB 7502作为标记抗体，用于提供检测信号。

2.2 荧光微球与单抗供价偶联

2.2.1 最佳偶联条件确定

通过对9组实验结果的检测来进行偶联条件优化，如下表2所示最终确定最佳的偶联条件为pH为7.0的缓冲溶液中，抗体终浓度为32.25μg/mL，温度为25℃，反应1h时为最佳偶联条件。

表2 偶联效率结果

2.2.2 荧光微球与抗体偶联表征

通过对市售荧光微球扫描电子显微镜分析鉴定其粒径、形状及分散均匀度。如图4所示，随机选取100个粒子，经过测量计算得到其平均直径为145nm，标准偏差为1.00nm，变异系数为5.78%，颗粒分散均匀呈圆球状，无聚沉。通过扫描电子显微镜进行荧光微球与抗体偶联后标记物的表征。如图5可以看出微球与抗体偶联后粒径明显增大，证明偶联成功并且分散度好，无聚沉现像。

图4 荧光微球表征

图5 荧光微球与抗体偶联表征

2.3 检测时间的确定

由于免疫层析过程中液体不断流动，荧光检测仪器检测到的数据处于不断的变化中，当数据稳定时说明层析完成。此时记录的时间为最佳检测时间。如图6所示，当检测到12min时，记录的T/C值趋于平稳，最后达到稳定值。为了能够准确的检测反应时测得的物质的含量，将12分钟定为最快的检测时间。

图6 CK-MB检测时间分析结果

2.4 CK-MB定量检测标准曲线及灵敏度

将CK-MB标准品稀释成1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、 125ng/mL、 625ng/mL、 1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL。每组各制作5个检测卡，通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度计算T/C线的荧光比值，求出算数平均值，根据数据制作出标准曲线，由标准曲线可知，范围在1ng/mL到1.0μg/mL时线性关系良好，R2＞0.99如图7所示。

图7 CK-MB标准曲线

图8 CK-MB标准品溶液不同浓度检测结果

当CK-MB的含量刚好达到试纸条的灵敏度时，C线与T线同时显色。所以当T线刚刚显色时的检测的CK-MB的含量即为该试纸条的可检测的灵敏度。通过对稀释的不同梯度浓度的CK-MB样品溶液进行检测，表明在CK-MB浓度为每毫升0ng～2μg时检测线呈现明显的梯度的变化，如图8所示，CK-MB标准溶液浓度分别为每毫升0.1ng、1ng、5ng、25ng、125ng、625ng、1000ng、1500ng、2000ng。当CK-MB含量大于1.0ng/mL时检测线无明显差距变化，即灵敏度1.0ng/mL。线性范围为当范围为1ng/mL～1.0μg/mL。当CK-MB浓度小于1.0ng/mL时，此荧光检测卡检测不出结果。

2.5 CK-MB试纸条重复性研究

在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，选用不同批次的试纸条对不同浓度的CK-MB标准品，每个条件重复三次，取平均值进行检测，检测结果如表3所示，回收率在84%～108.3%之间，CV值＜8%。结果显示批内批间重复性较好。

表3 CK-MB试纸条批间批内重复性结果

2.6 CK-MB免疫层析试纸条方法学比较及相关性测定

由实验结果取其中一组图片如图9及图10选可以看出，CK-MB的荧光微球试纸条与市售胶体金试纸条的相关性较好。检测结果都呈梯度显色。

图9 CK-MB荧光检测试纸条检测结果

图10 CK-MB胶体金检测试纸条检测结果

由表4的对比结果可知，CK-MB胶体金的检测限为5ng/ml，而CK-MB荧光微球的检测灵敏度明显比胶体金的值高。因此，在免疫层析方法中，荧光微球标记制作免疫层析试纸条检测CK-MB可提高检测灵敏度。

表4 CK-MB荧光免疫层析试纸条与胶体金方法比较结果

2.7 CK-MB免疫层析试纸条稳定性的研究

试纸条在组装完后，对其稳定性进行测试，在37℃放置7天的检测结果显示，C线与T线显色正常，初步可以确定试剂检测卡的稳定性良好。

3 结论

利用间接ELISA法对市售抗体进行筛选，获得了包被抗体anti-CK-MB 7501以及标记抗体anti-CK-MB 7502。通过优化荧光乳胶微球表面羧基活化条件，使得抗体与微球的偶联率达到91.7%，降低了试纸条的制备成本。制备的荧光免疫层析试纸条的检测范围为1ng/mL～1.0μg/mL，灵敏度达到了1ng/mL，回收率在84%～108.3%之间，CV值＜8%。与市售的CK-MB胶体金层析检测试纸条（POCT）相比，范围较宽，灵敏度强且稳定性好。与酶联免疫吸附法比，操作简便，速度快，12min即可完成。因此该研究的CK-MB荧光免疫层析技术及制备方法可以满足临床上的快速定量检测的需求，为其他心肌损伤标志物如Myo、cTnI等荧光免疫层析技术及试纸条开发提供了基础。

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Quantitative Determination of Creatine Kinase Isoenzyme Damage Markers with Fluorescence Immune Analysis

CHU Chunxu，SUN Xue，DING Qiuyu，LI Chao，YU Yuanhua
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Objective：creatine kinase isoenzyme （CK-MB） is the early diagnosis of acute myocardial infarction （AMI） isan important marker of the fluorescent microspheres as a marker of rapid and sensitive fluorescence immunochromatographic detection method CK-MB. Methods：the fluorescent microspheres were covalently conjugated to commerciallyavailable antibodies by N-hydroxysuccinyl （NHS） and 1-ethyl-3- （3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC），Optimizd the coupling conditions between antibody and fluorescent microspheres，characterized the complexes，prepared the fluorescent immunochromatographic assay card for CK-MB，estabilished the CK-MB fluorescence immunochromatographic assay. Results：coupling rate was 91.7%，detection linear range was 1ng/ml～1000ng/ml，sensitivity was 1ng/ml，CV＜8%，recovery rate was 84%～108.3%. Conclusion：the commercially available antibodies were screened by indirect ELISA method，obtained the coated antibody and the labeled antibody，proposed on creatine kinase isoenzyme fluorescence detection of myocardial injury markers，to achieve qualitative and quantitative detection of serum CK-MB，This study provides an experimental basis for the development of fluorescence immunochromatographic assays for myocardial injury markers.

myocardial injury markers；creatine kinase isoenzyme；fluorescent microsphere；fluorescence immunoassay chromatography

R-33

A

1672-9870（2017）05-0119-06

2017-06-22

褚春旭（1992-），女，硕士研究生，E-mail：930981208@qq.com

于源华（1963-），女，博士，教授，E-mail：yuyuanhua8888@126.com