针灸对气虚血瘀型糖尿病大鼠模型下肢血管病变的影响

陈自雅 江 岸 李 平 谢肄聪

1.天津市第五中心医院,天津 300450；2.天津医科大学研究生院,天津 300070；3.天津市南开医院,天津 300193；4.天津医科大学总医院,天津 300052

实验研究

针灸对气虚血瘀型糖尿病大鼠模型下肢血管病变的影响

陈自雅1江 岸2李 平3谢肄聪4

1.天津市第五中心医院,天津 300450；2.天津医科大学研究生院,天津 300070；3.天津市南开医院,天津 300193；4.天津医科大学总医院,天津 300052

目的：探讨针灸疗法对气虚血瘀证2型糖尿病大鼠下肢血管病变的影响。方法：将35只雄性SD大鼠分为对照组7只、模型组14只和针灸组14只。通过高脂喂养、大黄灌胃联合多次尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法建立气虚血瘀型2型糖尿病大鼠模型，针灸胰俞穴、足三里进行干预，动态观察针灸对2型糖尿病大鼠血清氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)和股动脉血凝素样氧化低密度脂蛋白受体LOX-1表达的影响。结果：与对照组比较，模型组大鼠血清Ox-LDL水平和LOX-1蛋白表达明显升高 (Plt;0.05)，与模型组比较，针灸组大鼠血清Ox-LDL水平和LOX-1蛋白表达显著降低 (Plt;0.05)。结论：2型糖尿病大鼠血清Ox-LDL显著升高，提示血管病变的发生，针灸干预可通过降低LOX-1蛋白表达抑制2型糖尿病大鼠血管病变。

血凝素样氧化低密度脂蛋白受体；针灸；糖尿病血管病变

糖尿病下肢血管病变作为2型糖尿病患者截肢、致残的主要原因，其病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)[1]。研究发现[2]，AS与脂代谢紊乱、氧化应激等关系密切，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是引发血管炎症反应，导致AS形成和发展的关键因素。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体 (LOX-1)是Ox-LDL特异性受体，在动脉粥样硬化产生和血管的验证反应性中发挥重要作用[3]。Liu等[4]研究显示正常人血管内膜LOX-1低水平表达，而在发生AS血管处的内皮细胞和巨噬细胞中LOX-1表达水平明显增加。研究通过动态观察针灸对2型糖尿病大鼠血清Ox-LDL和股动脉LOX-1表达的影响，探索针灸胰俞穴、足三里对2型糖尿病大鼠下肢血管病变影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级雄性8周龄SD大鼠35只，体重180～220g，许可证号SCXK(京)2009-0017，饲养于生物医学工程研究所动物实验中心饲养室。

1.2 试剂与设备 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；柠檬酸(天津市巴斯夫化工有限公司)；Ox-LDL试剂盒(北京鼎国昌盛生物有限公司)；LOX-1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；LOX-1β-actin(中杉金桥)。毫针(0.25mm×40mm，天津鹏世医疗器械销售有限公司，英迪 KWD-808Ⅰ型脉冲针灸治疗仪(常州英迪电子医疗器械有限公司)。

1.3 动物分组与造模 SD大鼠7只/笼，适应性喂养1周后，按随机数字表法分为对照组(7只)和实验组(28只)。对照组大鼠给予普通饲料喂养。实验组大鼠高脂饲料喂养6周，后2周联合大黄灌胃，于次日清晨称取实验组大鼠体重，按25mg/kg尾静脉注射STZ，1周后割尾法取血测血糖，随机血糖大于16.7mmol/L为T2DM造模成功，血糖不达标者按25mg/kg再次尾静脉注射STZ。高脂饲料配方：1%的胆固醇，10%的猪油，10%的蔗糖，0.3%的胆酸钠，其中78.7%为普通饲料。大黄煎剂的制备：按人与鼠1∶10 比例给药，10g 大黄颗粒剂溶解在50mL 80℃蒸馏水中浸泡5min，取出待其自然冷却，用纱布过滤，4℃冰箱保存，灌胃时用25℃温水浸泡至室温，按0.17g/100g 给药，隔日1次，共14d。按血糖水平、体重大小对实验组大鼠进行随机区组分组，分为模型组(n=14)和针灸组(n=14)。

1.4 干预方法 针灸组取“胰俞穴”和“足三里”，用英迪KWD-808 I型脉冲针灸治疗仪进行电针刺激，电流1mA，频率2Hz，同时艾灸胰俞穴和足三里，每次刺激10min，每日1次，共干预4周。期间模型组和针灸组继续高脂饲料喂养4周，每周测定体重、血糖。

1.5 动物取材与结果检测 所有大鼠处死前一天禁食，麻醉后腹主动脉抽血置于5mL促凝管中，2h内以2500rpm的速度离心约10～15min取血清，将血清置于-20℃冰箱，使用酶联免疫吸附 (ELISA)法测定血清Ox-LDL浓度。分离剪取双侧股动脉约1～2mm，立即放入冻存管丢入液氮中冻存，用于Western Blot测定LOX-1的蛋白表达量。

2 结果

2.1 气虚血瘀型T2DM模型的建立 采用高脂饲料喂养6周，后2周同时给予大黄灌胃，联合多次(间隔时间为7d，大部分经2次注射)尾静脉注射小剂量STZ(25mg/kg)的方法建立气虚血瘀型T2DM大鼠模型。造模后1周割尾法取血检测两组大鼠血糖，随机血糖大于16.7mmol/L者造模成功。造模1周后大鼠出现多饮、多尿、多食等典型的T2DM临床表现。同时出现毛发枯黄没有光泽，倦怠嗜睡，活动量明显减少，眼球暗红，爪甲青紫等气虚血瘀的临床表现。尾静脉注射后1周各组大鼠的尾静脉血糖水平见表1。由表1可知，与注射前比较对照组血糖无明显著变化(Pgt;0.05)，实验组大鼠血糖水平明显升高(Plt;0.05)。尾静脉注射前，实验组大鼠血糖水平正常，注射一周后血糖水平明显升高，且出现多饮、多尿、多食T2DM的临床表现和毛发枯黄没有光泽，倦怠嗜睡，活动量明显减少，眼球暗红，爪甲青紫等气虚血瘀的临床表现，符合气虚血瘀型T2DM的临床特征。

组别例数基础血糖尾静脉注射1周血糖对照组75.64±0.275.86±0.55实验组285.75±0.5524.44±3.40★

注：与本组注射前比较，★Plt;0.05。

2.2 血清Ox-LDL浓度 各组大鼠血清Ox-LDL浓度水平见表2和图1。与对照组比较，模型组大鼠血清Ox-LDL明显升高，差异有统计学意义(t=3.471，P=0.003lt;0.05)。与模型组比较，针灸组大鼠血清Ox-LDL明显降低，差异有统计学意义(t=2.239，P=0.036lt;0.05)，提示针灸能降低T2DM大鼠血清Ox-LDL水平。

组别例数Ox-LDL对照组75.36±0.41模型组146.16±0.49▲针灸组145.66±0.60◆

注：与对照组比较，▲Plt;0.05；与模型组比较，◆Plt;0.05。

2.3 LOX-1蛋白定量检测 各组大鼠股动脉组织LOX-1 Western Blot蛋白定量结果见表3和图2。与对照组比较，模型组的LOX-1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(t=2.235，P=0.038lt;0.05)。与模型组比较，针灸组的LOX-1蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(t=2.841，P=0.009lt;0.05)。提示T2DM大鼠股动脉LOX-1蛋白表达水平上调，针灸干预4周可以有效的抑制LOX-1蛋白表达水平上调。

组别例数LOX-1相对灰度值对照组70.68±0.07模型组140.91±0.26▲针灸组140.70±0.07◆

注：与对照组比较，▲Plt;0.05；与模型组比较，◆Plt;0.05。

3 讨论

2型糖尿病常伴糖脂代谢紊乱、高血糖和脂代谢紊乱通过多种途径产生过量活性氧(ROS)导致氧化应激，氧化应激引起LDL发生氧化修饰，生成Ox-LDL，LDL经氧化修饰形成Ox-LDL后不再与LDL受体结合， LOX-1表达于血管内皮细胞外膜上，作为Ox-LDL的主要受体，可特异性结合、摄取、降解Ox-LDL，同时诱导内皮细胞表达选择素、单核细胞趋化因子1、ICAM-1、VCAM-1等细胞因子，促进单核细胞在血管内皮的迁移、粘附，迁入内膜的单核细胞分化为巨噬细胞，进一步结合吞噬脂质转化为泡沫细胞。因此，LOX-1在糖尿病下肢血管病变形成发展过程中具有重要作用[5]。

本研究采用高脂饲料喂养、大黄灌胃联合多次尾静脉注射小剂量STZ(25mg/Kg)建立气虚血瘀型T2DM大鼠模型，针灸胰俞穴、足三里进行干预，血清Ox-LDL酶联免疫法(ELISA)检测结果显示，与对照组比较，模型组T2DM大鼠血清Ox-LDL表达明显增加，证实了Ox-LDL可促进T2DM血管病变的发生；而与模型组比较，针灸组大鼠血清Ox-LDL表达明显降低，说明针灸干预可通过降低Ox-LDL表达抑制T2DM血管病变。股动脉LOX-1免疫组化和Western Blot结果显示，与对照组比较，模型组T2DM大鼠LOX-1蛋白的表达显著增加，证实LOX-1可促进T2DM血管病变的发生；而与模型组比较，针灸组大鼠LOX-1蛋白表达明显降低，说明针灸干预可通过降低LOX-1蛋白表达抑制T2DM血管病变。

胰俞穴为胰脏的经气上输背部处，为治疗糖尿病的特效穴。现代研究显示，胰腺主要受T8神经支配，胰俞穴处有T8神经分布。因此针灸胰俞穴能够调节胰腺的功能，降低血糖。高珊等[6]研究表明，电针胰俞穴能够增强胰岛素敏感指数。足三里分布在胃经上，脾胃为气血生化之源，因此针灸足三里能够补益气血、行气活血。王景等[7]研究表明足三里穴位注射可降低糖尿病患者证候积分。《素问·举痛论》记载：“寒气入经……泣而不行……得灸而痛立止”。大量研究也表明艾灸能够温经散寒、活血行气。针灸对糖尿病的作用已得到广泛认可，但其具体作用机制尚不明确。李梦等[8]研究表明，电针“内关”、“心俞穴”能够减少冠心病大鼠Ox-LDL和LOX-1的表达。

研究针对LEAD选取“胰俞穴”、“足三里”，针灸两穴进行干预治疗，与模型组比较，针灸组大鼠Ox-LDL的表达显著降低 (Plt;0.05)，LOX-1蛋白表达显著降低(Plt;0.05)。针灸可能通过降低2型糖尿病大鼠下肢血管LOX-1、Ox-LDL的表达水平，发挥改善2型糖尿病大鼠下肢血管病变的作用。

[1]管珩,刘志民,李光伟,等.50 岁以上糖尿病人群周围动脉闭塞性疾病相关因素分析[J].中华医学杂志, 2007,87(1): 23-27.

[2]陈家伟.糖尿病动脉粥样硬化中的炎症机制[J].国外医学·内分泌学分册, 2004, 24(4):2-3.

[3]杜月光,钱俊文,宋光明,等.LOX-1在2型糖尿病大鼠肾小管间质中的表达及其意义[J].中国病理生理杂志,2013,29(1):50-55.

[4]Liu J, Grundy SM, Wang W, et al.l Ten-year risk of cardiovascular incidence related to diabetes, prediabetes, and themetabolic syndrome [J]. Am Heart J,2007,153(4): 552-558.

[5]Geneviève, Renie.Diabetic vasculopathy and the lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1). Current diabetes reviews[J].2007,3(2):103-110.

[6]高珊,李瑞,田环环,等.针灸“胰俞”穴对2型糖尿病大鼠HPA轴相关激素的影响[J].中国针灸,2014,34(1):1099-1110.

[7]王景,滕琳,郭伟光.足三里穴位注射对糖尿病下肢血管神经病变患者神经传导速度的影响[J].中医药信息,2014,31(1):42-44.

[8]李梦,蔡荣林,胡玲,等.针灸对冠状动脉粥样硬化性心脏病模型大鼠血清氧化低密度脂蛋白及其受体表达的影响[J].中国针灸,2013,33(9):817-820.

Effect of Acupuncture and Moxibustion on Vascular Lesions of Lower Limbs in Diabetic Rats with Qi Deficiency and Blood Stasis Syndrome

CHEN Ziya1JIANG An2LI Ping3XIE Yicong4

1.The Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450, China;2.Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;3.Tianjin Hospital of Itcwm Nankai Hospital, Tianjin 300193, China;4.General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Objective To investigate the effect of acupuncture on lower extremity vascular disease in type 2 diabetic rats with Qi deficiency and blood stasis syndrome. Methods 35 male SD rats were divided into two groups: control group of 7, model group of 14 and acupuncture group of 14. The high fat diet, rhubarb combined with multiple intravenous injection of a small dose of streptozotocin (STZ) of qi deficiency and blood stasis rat model of type 2 diabetes, Yu Xue, Zusanli acupuncture pancreas intervention, dynamic observation of acupuncture effect on the expression of LOX-1 in serum of Ox-LDL vein and femoral in type 2 diabetic rats. Results Compared with the control group, the expression of model group rats serum levels of Ox-LDL and LOX-1 protein increased significantly (Plt;0.05), compared with the model group, the expression of acupuncture group rats serum levels of Ox-LDL and LOX-1 protein decreased significantly (Plt;0.05).Conclusion The serum Ox-LDL levels in type 2 diabetic rats increased significantly, suggesting the occurrence of vasculopathy, and acupuncture intervention could inhibit the vascular lesion in type 2 diabetic rats by decreasing the expression of LOX-1 protein.

Lectin Like Oxidized Low-density Lipoprotein Receptor; Acupuncture; Diabetic Angiopathy

R-33

A

1007-8517(2017)20-0042-04

塘沽科委科技基金项目(2013KJXQ02)。

陈自雅(1969-)，女，汉族，本科，主任医师，研究方向为中医针灸治疗常见病。E-mail：a11bb@126.com

2017-08-26 编辑：穆丽华)