半夏白术天麻汤4种方法≤1000Da小分子混合物对高血压大鼠血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和内皮素含量的影响

王淑玲，徐 男，孙剑锋，周晓晓，谢 恬，蔡梅超

(1.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 310012；2.山东中医药研究院 国家中医药管理局中药分析重点学科，山东 济南 250014；3.山东中医药大学，山东 济南 250355)

半夏白术天麻汤4种方法≤1000Da小分子混合物对高血压大鼠血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和内皮素含量的影响

王淑玲1，徐 男2，孙剑锋1，周晓晓1，谢 恬1，蔡梅超3

(1.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 310012；2.山东中医药研究院 国家中医药管理局中药分析重点学科，山东 济南 250014；3.山东中医药大学，山东 济南 250355)

目的比较半夏白术天麻汤不同提取方法对大鼠血浆中一氧化氮、血管紧张素Ⅱ和内皮素含量的影响。方法选用高血压大鼠，随机分为正常对照组、空白对照组、半仿生酶组(Semi-Bionic Enzyme Extraction，SBEE)、半仿生组(Semi-Bionic Extraction，SBE)、水提组(Water Extraction，WE)、醇提组(Alcohol Extraction，AE)，分别灌胃相应提取液，每鼠每天1mL(浓度2.83g·mL-1)。喂养4W，分别测定血清中一氧化氮、血管紧张素Ⅱ和内皮素含量。结果4种方法提取液均可提高模型大鼠血清中一氧化氮含量，降低模型大鼠血清中血管紧张素Ⅱ和内皮素含量；差异均有统计学意义(均Plt;0.05)。结论经过4周的喂养，半夏白术天麻汤四种方法提取液均可提高模型大鼠血清中一氧化氮的含量，降低血清中血管紧张素Ⅱ和内皮素的含量，加入酶解过程的SBEE提取方法效果显著。

半夏白术天麻汤；≤1000Da提取液；一氧化氮；血管紧张素Ⅱ；内皮素

半夏白术天麻汤来源于《医学心悟》，临床主要用于治疗高血压病痰湿壅盛证[1-3]。半仿生提取法(Semi-Bionic Extraction，SBE)由张兆旺教授提出，至今已有21年的发展历史；半仿生-酶法(Semi-Bionic Enzyme Extraction，SBEE)将生物酶引入SBE法，是SBE的发展。本实验选用一定规格中空纤维膜截留相对分子质量≤1000Da提取液，采用痰湿壅盛型高血压大鼠模型，进一步研究半夏白术天麻汤的药效学；为建立一种中药用半仿生提取法研究的技术平台奠定基础，也为进一步验证该方小分子提取物有效性提供依据。

1材料与方法

1.1 仪器与材料 Beckman CX7全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；Cobase 411全自动化学发光分析仪(美国罗氏诊断有限公司)；P-6型动物无创血压测试仪(成都泰盟科技有限公司)；BL-420E+型生物机能实验系统(四川成都泰盟电子公司)；全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

本实验所用中药由张兆旺教授鉴定：半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎；白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎；天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘红为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥外层果皮；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根茎。提取液 SBEE、SBE、WE、AE制备按照实验要求[4]。

1.2 实验动物与造模 雄性Wistar大鼠90只，体重180～200g，由山东中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXR〈鲁〉20090012。分成6组，每组15只；每日明暗时间各12h，室温25℃，湿度50%。对照组喂普通饲料，模型组喂高脂高盐饲料[5]；持续喂16W后测量体重、尾动脉收缩压、舒张压。收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90mmHg；同时体形肥胖，体重明显增加，懒动，不思饮水，纳呆嗜睡，大便不成形者为痰湿壅盛型高血压大鼠模型。

1.3 药物干预 将痰湿壅盛型高血压大鼠随机平均分为6组：正常组、空白对照组、SBEE组、SBE组、WE组、AE组。均喂普通饲料，空白对照组饮去离子水；SBEE组、SBE组、WE组、AE组分别灌胃相应提取液。每鼠每天1mL(2.83g·mL-1)。正常血压大鼠8只作为对照组，同法喂养4W，取大鼠尾静脉血。

1.4 含量测定 给动物腹腔注射10%的水合氯醛溶液进行麻醉，剖腹腔，肝门静脉取血，全血4℃离心20min(3500r·min-1)，收集上清液待用。按文献应用双抗夹心法测定待测标本中血管紧张素Ⅱ水平[6]。加样品稀释液90μL在酶标包被板上，再加待测样品10μL，充分混匀置37℃ 120min；按文献应用双抗夹心法，酶标仪在450nm处测OD值，计算一氧化氮的含量[6-7]。在酶标包被板上先加样品稀释液40μL，待测样品10μL，温育30min。弃液体，洗涤液5次，拍干；空白孔除外，每孔加酶标试剂50μL，温育30min；弃去液体，甩干，洗涤5次，拍干；显色，终止反应；以空白孔调零，450nm波长测量各孔的OD值，计算内皮素的含量。

1.5 统计学分析 采用SPSS13. 0 统计软件包进行单因素方差分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.2 综合评判R值 将R1～R3求平均值得RA，为对高血压痰湿壅盛型大鼠血清影响的综合评价值，大者为佳。由表2中数据可知，SBEE法综合评判R值最大，即半夏白术天麻汤提取方法以SBEE法对实验大鼠血清相关指标影响最大，提示药效更显著。

表1 治疗后各组大鼠血清NO、血管紧张素Ⅱ和内皮素情况

注：△与空白对照组比较，P﹤0.05；#与正常对照组比较，P﹤0.05。

表2 实验后各组大鼠各指标综合评判RA值

注：①RA=(R1+R2+R3)/3

3 讨论

高血压病在中医学中属于“眩晕”范畴。分为肝火亢盛型、肝肾阴虚型、痰湿壅盛型、瘀血阻络型。现代医学原发性高血压根据 Lragah等的意见，认为可以分为二大类型：一类属于肾素依赖型，另一类为容量依赖型。随着祖国医学对原发性高血压的分型研究的不断深入，也有各种不同的分型，近年来，我们对这方面的研究发现，原发性高血压患者绝大多数属于阴虚阳亢型及气阴两虚型，这二大类型不但有明确不同的中医辨证见证，而且有不同的病理生理改变，与现代医学的分型也有一定的关系。

半夏白术天麻汤为中医经典方剂，来源于《医学心悟》。由半夏、天麻、茯苓、橘红、白术、甘草组成。具有燥湿化痰，平肝息风的作用。主治风痰上扰所致眩晕头痛，胸闷呕恶，舌苔白腻，脉弦滑等证。为治风化痰的代表方剂，现代用于治疗痰湿壅盛型高血压、痰湿型内耳眩晕证(美尼尔氏综合征)，痰迷心窍所致的癫痫，风痰阻痹经络之中风及后遗症等。风痰诸证病缘于脾湿生痰，痰阻清阳，加之肝风内动，风痰上扰清空所致。前人有“无痰不作眩”，“诸风掉眩，皆属于肝”之说。肝风内动，则头眩物摇，又因湿痰上扰，浊阴上逆，故眩晕更甚，自觉天旋地转，遂作呕吐恶逆。治宜化痰息风。方中半夏辛温，长于燥湿化痰，降逆止呕以治其本；天麻甘平，善于平肝息风止晕而治其标。二药合用，标本兼顾，功专化痰息风为君药。以白术为臣，健脾燥湿，与半夏、天麻配伍，祛湿化痰、止眩之功益佳。佐以茯苓健脾渗湿，与白术相伍，尤能治生痰之本；橘红理气化痰，使气顺则痰消。使以甘草调药和中，诸药合用，共奏化痰息风之效。风息痰消，眩晕自愈。

肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)与高血压的相关性，主要集中在肾素活性( plasmatic renin activity，PRA)、AngⅡ水平等方面[8]。AngII是RAS的主要活性物质，为血管活性肽和生长因子，可收缩肾小球小动脉，引起肾小球毛细血管静水压升高，亦可刺激系膜细胞内DNA 和蛋白质合成，使系膜细胞增殖和肥大[9]。目前，血管紧张素受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers，ARBs) 和血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI) 类药物广泛用于临床治疗高血压。

痰湿壅盛是高血压重要证型之一。现代研究表明，高脂血症与中医痰浊密切相关，痰浊是高血压病的重要病机之一。痰证与血液流变学、与氧自由基、糖代谢、能量代谢酶等皆密切相关。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成是对内皮细胞的损伤的重要环节。内皮细胞释放ET 、NO等物质，ET和NO是维持血管的正常状态、功能的重要物质。当ET及NO系统信号通路异常，会引起血管内皮功能紊乱、内皮坏死、血管壁破坏。甚至引起血管内局部缺氧、代谢物堆积等，最终导致血压升高、微循环障碍等[10]。

AngⅡ、ET含量升高以及NO含量降低在高血压的发病中起着极为重要的作用，是导致高血压发病并使之持续的重要机制之一。ET是目前已知的体内最强的血管收缩因子，NO是内皮细胞释放的舒张血管物质。高血压病人的血管内皮细胞的结构和功能发生改变，NO合成或分泌不足。ET可催化合成AngⅡ,AngⅡ可诱导增强内皮细胞ET基因表达，故AngⅡ和ET是相互促进的关系。NO可抑制ET和AngⅡ的的生成和释放。

为探索多种提取方法半夏白术天麻汤的对血管活性因子影响，进一步探索该方对痰湿壅盛性高血压的作用机理。本研究选取药效指标AngⅡ、ET、NO。考察指标≤1000Da分子量的提取物。由于目前大多数中药的药效物质基础不明确，研究证明，吸收入血的成分一般为小分子物质，故选取≤1000Da分子量的提取物为指标[11]，优选工艺和控制质量，更能体现中药整体、综合、客观、模糊的特点，对中药现代化研究很有借鉴意义[12]。并且与粗提物相比，降低提取物量，缩小剂量，也为选用现代新剂型开发产品提供了可能。

实验结果表明半夏白术天麻汤提取液可提高痰湿壅盛型高血压大鼠血清中NO的含量，R1值的大小次序为SBEE组、SBE组、AE组、WE组。提取液可降低痰湿壅盛型高血压大鼠血清中AngⅡ和ET的含量，其中，SBEE液作用最佳。提示，该方通过影响AngⅡ、ET、NO的含量，治疗湿壅盛型高血压。

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EffectsofBanxiaBaizhuTianmadecoctions(≤1000Da)onthecontentofangiotensinⅡ，NOandendothelininhypertensionrats

WANG Shu-ling1, XU Nan2,SUN Jian-feng1, ZHOU Xiao-xiao1, XIE Tian1，CAI Mei-chao3

(1.CollegeofMedicine，HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310012； 2.KeydisciplinesonAnalysisofTraditionalChineseMedicine,ShandongAcademyofChineseMedicine,Jinan250014；3.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of Banxia Baizhu Tianma decoctions extracted by diferent methods on the content of angiotensin Ⅱ、NO and endothelin in rat plasma.MethodHypertensive rats were randomly divided into six groups, namely, normal control group, the control group, SBEE group, SBE group, WE group and AE group, and fed with the respective extract, per mouse 1mL (2.83g·mL-1) per day. Four weeks after feeding, the content of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and endothelin levels were determined.FindingsFour methods could increase serum nitric oxide content of the model rat and reduce serum angiotensin Ⅱ and endothelin .The differences were statistically significant.ConclusionAfter four weeks of feeding, four-method extract of Banxia Baizhu Tianma decoctions could increase the content of serum nitric oxide and reduce the content of angiotensin Ⅱ and endothelin. The effect of SBEE extraction with the enzymolysis process is remarkable.

Banxia Baizhu Tianma decoction; ≤1 000 Da extraction ; angiotensin Ⅱ; NO; endothelin; hypertension

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.05.010

2017-05-05

浙江省自然科学基金(LY16H270018)；国家科技部国际合作项目(2007DFA31180)。

王淑玲(1972 - )，女，山东利津人，博士，讲师。

R285.5

A

1674-6449(2017)05-0510-04