补阳还五汤联合依达拉奉对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

钟芳芳 吴承龙 孙新芳 章燕幸

(绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院神经内科，浙江 绍兴 312000)

补阳还五汤联合依达拉奉对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

钟芳芳 吴承龙 孙新芳 章燕幸

(绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院神经内科，浙江 绍兴 312000)

目的研究补阳还五汤联合依达拉奉对小鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响。方法50 只小鼠随机分假手术组，模型组，补阳还五汤(BYHWD)组，依达拉奉(ED)组，补阳还五汤+依达拉奉(BYHWD+ED)组，每组再随机分成缺血再灌注后1、7 d组。首先制备小鼠大脑中动脉缺血模型，TUNEL法观察神经细胞凋亡率，应用免疫组化方法观察各组大脑皮质Bcl-2、Bax、Caspase-3表达阳性细胞数。结果与模型组比较，BYHWD组、ED组及BYHWD+ED组均能明显降低脑组织凋亡指数(Plt;0.01)，升高Bcl-2阳性表达，降低Bax、Caspase-3阳性表达(Plt;0.01)，两药联用变化趋势更明显。结论补阳还五汤与依达拉奉联用能降低脑缺血再灌注损伤模型鼠脑组织细胞凋亡基因Bax、Caspase-3的表达，增加具有神经元保护作用的Bcl-2基因表达，从而抑制神经细胞凋亡，加速神经功能的恢复，协同发挥脑保护作用。

补阳还五汤；依达拉奉；脑缺血再灌注；细胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2/Bax

缺血性脑血管病的发病是一个多环节、多反应的结果，减轻脑缺血半暗带区的神经元凋亡则是治疗的关键〔1〕。本研究采用有益气活血通络之功的补阳还五汤联合抗氧自由基的神经保护剂依达拉奉作用于小鼠脑缺血再灌注损伤模型来探讨两药联用对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要药品、试剂及仪器 依达拉奉注射液(南京先声东元制药有限公司)；补阳还五汤(绍兴市人民医院制剂室提供，由黄芪120 g，当归6 g，川芎3 g，地龙3 g，赤芍5 g，红花3 g和桃仁3 g组成，水煎、浓缩后生药含量为2.0 g/ml)。氯化三苯基四氮唑(TTC,中国医药集团上海化学试剂公司)。TUNEL凋亡试剂盒(瑞士Roche公司，批号11684817910)；免疫组化染色试剂盒：Bcl-2(批号20070223)，Bax(批号20070223)，Caspase-3(批号20070227)，均购自武汉博士德生物工程有限公司。二氨基联苯胺(DAB，购自北京中山试剂公司)。CM1850 冰冻切片机(德国Leica)；光学显微镜、光学显微数码成像系统(日本Olympus公司)。

1.2动物分组及给药 选择8月龄C57BL/6雄性小鼠50只，体重45～50 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，合格证号：scxk(沪)2008-0016。实验前先饲养观察3 d，随机分成假手术组(分离不插栓塞线)，模型组(缺血90 min)，补阳还五汤组(BYHWD组)，依达拉奉组(ED组)，补阳还五汤+依达拉奉组(BYHWD+ED组)，每组10 只。术后1、7 d每组随机取5只。BYHWD组于术后2 h起首次灌服补阳还五汤药液，按10 ml/kg给药；ED组于术后2 h尾静脉注射，按3 mg/kg给药；BYHWD+ED组，于术后2 h分别予等剂量BYHWD灌胃和ED尾静脉注射给药；模型组和假手术组动物均给予等量生理盐水灌胃及尾静脉注射给药；首次给药以后1次/d，连续7 d。

1.3小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型制作 参照改良的Longa-Zea线栓法〔1〕制作小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。缺血90 min后，拔出线栓再灌注。假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉，不予栓塞。术后2 h根据神经功能评分验证造模成功。观察造模动物出现右侧Horner征和左侧以上肢为重的偏瘫作为动物模型成功的判定标准，不符合标准的动物予以剔除，并随机补充。小鼠在脑缺血再灌注1、7 d后经10%水合氯醛深度麻醉(600 mg/kg)，迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，快速注入150 ml甲醛灌注固定，断头取脑，沿视交叉后缘做冠状切片，常规石蜡包埋，做5 μm连续切片用于凋亡与免疫组化检测。

1.4TUNEL法检测神经细胞凋亡 按照试剂盒说明书进行操作。①切片常规脱蜡至水，滴加蛋白酶K室温消化20 min；②微波修复抗原5 min后自然冷却；③滴加TUNEL反应液，37℃孵育1 h；④滴加辣根过氧化物酶标抗荧光素抗体工作液，37℃孵育30 min；⑤用DAB显色剂呈色；⑥常规脱水、透明、封片。在光镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。计算凋亡指数(AI)，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5免疫组化检测 切片常规脱蜡至水，滴加3%H2O2孵育10 min；微波修复抗原10 min自然冷却至室温；滴加10%正常山羊血清，室温封闭30 min；分别滴加兔抗Bcl-2、兔抗Bax 及兔抗Caspase-3抗血清，4℃孵育24 h；滴加二抗工作液(山羊抗兔)室温反应15 min；滴加辣根酶标记卵白素工作液，室温反应15 min；DAB显色剂呈色；梯度脱水、中型树脂封片。在光镜下观察，细胞质有棕黄色颗粒者为阳性细胞。计算阳性染色神经细胞数目。在光镜下，每只小鼠各取两张切片，在梗死灶周边区随机选择5个视野，分别分析Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性细胞百分数及神经细胞AI，取平均值。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验，单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组神经细胞AI比较 脑缺血再灌注1、7 d后，模型组和各用药组神经细胞AI均较假手术组明显升高(Plt;0.01)；且与缺血再灌注1 d相比，7 d时模型组和各用药组神经细胞AI明显降低(Plt;0.01)。与同时段模型组比较，各用药组神经细胞AI显著降低(Plt;0.05)；其中以BYHWD+ED组降低趋势最明显，但ED组和BYHWD组无显著差异(Pgt;0.05)，见表1。

表1 各组神经细胞AI比较

与假手术组比较：1)Plt;0.01；与模型组比较：2)Plt;0.01；与ED或BYHWD组比较：3)Plt;0.05；与同组内1 d比较：4)Plt;0.01，下表同

2.2各组Bcl-2、Bax表达及Bcl-2/Bax比较 脑缺血再灌注后，模型组脑组织Bcl-2、Bax表达较假手术组明显升高(Plt;0.01)。与缺血再灌注1 d相比，7 d时模型组和各用药组脑组织Bcl-2、Bax基因表达明显减少(Plt;0.01)。在同一时间点各用药组与模型组比较：脑组织Bcl-2基因表达均明显增加(Plt;0.01)，而Bax基因表达有下降，以7 d时明显(Plt;0.05)；且BYHWD+ED组改变趋势最明显(Plt;0.05)，BYHWD组和ED组之间则无显著差异(Pgt;0.05)。同一时间点，各用药组较模型组Bcl-2/Bax有所增高，其中以BYHWD+ED组比值增高最明显(Plt;0.05)。见表2。

表2 各组Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比较

2.3各组Caspase-3表达比较 脑缺血再灌注后，模型组及各用药组神经细胞Caspase-3表达较假手术组明显增高(Plt;0.01)。与缺血再灌注1 d相比，7 d时模型组与各用药组神经细胞Caspase-3阳性细胞数显著降低(Plt;0.01)。与模型组同时间点比较，各用药组神经细胞Caspase-3阳性细胞数显著降低(Plt;0.05)，以BYHWD+ED组为著(Plt;0.05)。见表3。

表3 各组小鼠脑缺血再灌注损伤后神经元Caspase-3的表达

3 讨 论

脑缺血再灌注后神经细胞损伤主要包括坏死和凋亡。缺血中心区细胞迅速坏死，而周边缺血半暗带区，则发生以凋亡为主的迟发性死亡〔2〕。因此，抢救半暗带区神经细胞，减少细胞凋亡发生能减轻脑缺血再灌注损伤的程度和范围〔3〕。但细胞凋亡的发生受复杂的多基因、多系统调控。线粒体凋亡主要通过Bcl-2家族蛋白调节，而Bcl-2和Bax是Bcl-2家族参与细胞凋亡调控最具代表性的基因〔4〕。前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡，Bcl-2与Bax蛋白可相互结合形成结合体，过度表达Bax蛋白可促进细胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bcl-2/Bax的比值变化则决定细胞的凋亡与生存，比值越高，细胞存活率越高；比值越低，细胞凋亡率越高〔5，6〕。此外，Caspase-3是细胞凋亡的敏感指标，被认为是细胞凋亡蛋白酶级联反应最关键的执行者，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用〔7〕，阻抑Caspase-3表达对阻止脑损伤的进一步恶化和改善神经功能具有重要意义。补阳还五汤具有益气活血通络之功，通过多环节、多靶点发挥神经保护作用〔8，9〕。依达拉奉具有清除自由基和抑制脂质过氧化的作用，可抑制神经、血管内皮细胞的过氧化及迟发性死亡，减轻脑水肿及组织损伤，并可促进神经营养因子的产生〔10，11〕。本研究提示脑缺血再灌注损伤可引起神经细胞凋亡发生，随时间延长细胞凋亡呈减轻趋势；BYHWD和ED对神经细胞的凋亡具有抑制作用，以两者联用的效果尤为显著。本实验表明BYHWD和ED可通过促进重要的凋亡抑制基因Bcl-2的表达，抑制凋亡诱导基因Bax及Caspase-3的表达，从而抑制神经细胞凋亡，加速神经功能的恢复，协同发挥脑保护作用。

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6宋修云，胡金凤，陈乃宏. 神经细胞凋亡与脑缺血疾病〔J〕. 中国药理学通报，2012；28(3)：307-10.

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8龙建飞，张秋霞，王 蕾，等.补阳还五汤治疗缺血性中风药理作用机制的研究进展〔J〕.世界中医药，2015；10(5)：805-7.

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11朱 江，周志强，窦志杰，等.依达拉奉对大鼠脑缺血后丘脑微血管密度、神经生长因子、脑源性神经生长因子表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(22)：6423-4.

〔2016-10-08修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R34

A

1005-9202(2017)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.015

绍兴市公益性技术应用研究计划项目(No.2013B70076)

钟芳芳(1977-)，女，硕士，副主任医师，主要从事脑血管病研究。