叶面喷施不同浓度ALA对黄瓜幼苗抗氧化酶系统的影响

张治平+戴海博+耿园

摘 要：为了探讨叶面喷施5-氨基乙酰丙酸（ALA）在黄瓜苗期的施用浓度和效果，以黄瓜品种津春4号3叶1心期的幼苗为材料，研究了不同浓度ALA对黄瓜幼苗叶片光合色素含量和抗氧化酶系统的影响。试验结果表明，叶面喷施10、30、50 mg/L的ALA可明显提高黄瓜叶片叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）含量，降低Chl a/b比值；显著增加超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）活性，脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低超氧阴离子（O2-·）生成速率、过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量；当ALA浓度达100 mg/L时，黄瓜幼苗受到一定的氧化胁迫伤害。这些结果说明，喷施浓度不超过100 mg/L ALA可促进黄瓜幼苗叶片光合色素的合成、增加其抗氧化能力，降低膜脂过氧化的程度，综合各项指标，以30 mg/L的ALA叶面喷施浓度在黄瓜幼苗上效果最佳。

关键词：黄瓜；5-氨基乙酰丙酸（ALA）；叶绿素；抗氧化酶；氧化胁迫

中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）20-0088-05

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物体内卟啉化合物（包括叶绿素、亚铁血红素、光敏素等）生成合成的第一个关键前体，与植物的光合作用、呼吸作用等有着密切关系，能够调节植物的生长发育，促进作物的产量，提高植物的抗逆性[1～3]。然而ALA在黄瓜上的作用效果和施用浓度，目前存在著很大的差异。刘玉梅等[2]认为0.5 mg/L ALA喷洒幼苗可以提高黄瓜品种津优1号叶片净光合速率（Pn）和光化学效率，提高黄瓜幼苗亚适宜温光环境的光合适应性。Zhen等[3]则认为50 mg/L ALA缓解盐胁迫对津春2号黄瓜造成的伤害最明显。Tripathy等[4]研究表明，喷施20 mmol/L ALA能够造成黄瓜的光合电子传递链的光动力损伤。为了确定叶面喷施ALA在黄瓜幼苗期的最佳施用浓度和应用效果，本试验以黄瓜（Cucumis sativus L.）品种津春4号为材料，研究叶面喷施不同浓度ALA对黄瓜幼苗叶片叶绿素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白的含量、以及O2-·生成速率和MDA含量的影响，皆在探讨ALA在黄瓜应用上的浓度效应，以期为ALA在黄瓜生产上的推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料培养

本试验以黄瓜品种津春4号为材料。挑选饱满的种子用50℃温水浸种灭菌10 min，30℃恒温箱中催芽 2 d，种子露白时，播种于装有育苗专用基质（镇江兴农有机肥有限公司）的10 cm×10 cm（高度×口径）黑色营养钵中，放入步入式植物生长箱（GBC-1600K型培养箱，宁波江南仪器厂）内，培养条件设定温度为（25±1）℃/（18±1）℃（昼/夜），光周期为12 h/12 h（昼/夜），最大光照强度为10万lx，育苗期间每天上午8：00浇透水。

1.2 材料处理

黄瓜幼苗培养至3叶1心期，选取生长一致的植株，用10、30、50、100 mg/L的ALA（粉剂，购于Sigma公司）溶液喷施，并设清水（0 mg/L ALA）对照。喷施时溶液中添加0.01% Triton，均匀的喷洒叶片的正反面，以叶片滴水为喷施标准。每个处理重复3次，每个重复20棵植株。ALA处理后第 4天，取第2片真叶测定相关指标。

1.3 试验方法

①叶片光合色素的含量测定 采用参照Lichtenthaler[5]的方法，将黄瓜叶片剪碎放入小试管中，用 95%乙醇提取液黑暗中静置提取24 h，测定470、649、665 nm的OD值，并计算叶绿素 a（Chl a）、叶绿素 b（Chl b）、总叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）的含量以及Chl a/b的比值。

②抗氧化酶活性测定 SOD 活性测定按照 Beauchamp等[6]的氮蓝四唑（NBT）光还原法进行，以引起50%光化还原抑制率的酶量为一个酶活性单位（U）。CAT活性测定参照Change 等[7]的方法，以每1 min OD240值减少0.01为1个酶活力单位（U）。APX 活性测定参照Nakano等[8]方法。POD 活性测定采用愈创木酚法，通过测定OD460的变化以测定POD的活力[7]。

③脯氨酸含量测定 脯氨酸含量测定参照张殿忠等[9]的磺基水杨酸提取法。

④可溶性蛋白含量测定 可溶性蛋白含量的测定按照 Bradford[10]的考马斯亮蓝G-250染色法，并以标准的BSA作对照。

⑤O2-·生成速率、H2O2和MDA含量测定 O2-·生成速率测定采用α-萘胺法[11]，H2O2含量的测定参照 Brennan 和Frenkel方法进行[12]，MDA 含量的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法，以μmol·g-1 （鲜样质量）表示[13]。

⑥统计分析 上述各项指标的测定，均重复3次。采用Excel 2011和SAS软件对数据进行统计分析和差异显著性检验，并作图。

2 结果与分析

2.1 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片光合色素的影响

喷施ALA可以明显改变黄瓜叶片光合色素的含量，不同浓度的ALA的喷施效果差异较大。喷施10、30、50 mg/L ALA可以明显提高黄瓜叶片叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）的含量，显著降低了Chl a/b的比值；与喷施清水对照（0 mg/L ALA）相比，黄瓜叶片的Chl a、Chl b、总Chl和Car的含量分别提高了3.92%～10.8%、13.1%～23.7%、6.81%～16.1%和1.26%～7.18%，同时Chl a/b的比值降低了7.92%～12.9%，ALA的作用效果30 mg/L ALA>50 mg/L ALA>10 mg/L ALA，30、50 mg/L ALA的作用效果与对照相比均达到了差异显著水平。然而随着ALA浓度继续升高（至100 mg/L），与对照相比，黄瓜叶片的Chl a和Car的含量显著降低；Chl b和总Chl的含量以及Chl a/b的比值无显著变化（表1）。endprint

2.2 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响

与对照相比，4种浓度ALA处理均增加了黄瓜叶片SOD、CAT、APX和POD 的活性。但ALA对黄瓜幼苗叶片4种抗氧化酶活性的作用效果不一样，即随着ALA浓度的增加，SOD的活性逐渐增加，而CAT、APX和POD的活性则呈现先增加再减少的趋势。黄瓜叶片SOD、CAT、APX和POD对ALA施用浓度反应也不一样。喷施10、30、50、100 mg/L ALA處理的黄瓜叶片SOD 的活性分别增17.4%。48.5%、56.2%、65.7%，且并到达了差异显著水平（P<0.05），但3种ALA浓度之间没有明显差异。ALA浓度为30、50 mg/L时，对APX、CAT和POD 活性的增加效果显著，为1.63～2.15倍；与对照相比，当ALA浓度为50 mg/L时，对APX 和CAT 活性增加的效果最为明显，分别为93.3%和115.2%，POD 活性增加的效果在ALA浓度为30 mg/L时表现的最明显，其活性增加了105.3%。然而，当ALA浓度到达100 mg/L，CAT、APX和POD 的活性有一定程度的降低，但仍显著高于对照（P<0.05）（图1）。

2.3 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

喷施10、30、50、100 mg/L ALA的黄瓜叶片脯氨酸的含量显著增加（P<0.05），与对照相比分别提高了103%、192%、211%和115%。除100 mg/L的ALA处理对黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量影响不显著外，其他处理的黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量显著地高于对照（P<0.05），30 mg/L和50 mg/L ALA处理对黄瓜叶片的可溶性蛋白含量增加的效果较好，比对照提高了11.0%和14.3%（表2）。

2.4 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片O2-·生成速率、H2O2和MDA含量的影响

与对照相比，叶面喷施10、30、50 mg/L ALA显著降低了黄瓜叶片O2-·生成速率，这3个ALA浓度处理的黄瓜叶片O2-·生成速率只有对照的61.4%～72.5%，以30 mg/L的ALA处理的O2-·生成速率降低的最为明显；而100 mg/L的ALA处理的黄瓜叶片O2-·生成速率与对照相比差异不显著。叶面喷施ALA对黄瓜叶片H2O2和MDA 含量变化的影响效果一致，表现为10 mg/L ALA对黄瓜叶片H2O2和MDA 含量没有明显影响；喷施30、50 mg/L ALA的黄瓜叶片H2O2和MDA含量与对照相比分别下降了74.8%～78.9%和69.5%～70.2%；当ALA浓度到达100 mg/L，黄瓜叶片H2O2和MDA 含量比对照分别增加了123%、118%，增加效果显著（P<0.05）（表2）。

3 讨论

在植物体内，ALA是叶绿素和血红素的生物合成的第一个关键前体，CAT、POD和APX 同属于亚铁血红素蛋白酶类，因而外源施用ALA，叶绿素含量和抗氧化酶活性的变化最能直观地反映出外源ALA的作用效果[1，14～16]。本研究发现低浓度ALA处理（10～50 mg/L）黄瓜幼苗，不仅能促进黄瓜叶片光合色素Chl a、Chl b、总Chl的增加，还对叶绿素的成分比例产生影响，ALA对Chl b的促进作用效果明显大于Chl a，表现为与喷施清水对照相比Chl a/b的比值明显降低。同时喷施10～50 mg/L ALA可以增加黄瓜叶片抗氧化酶SOD、CAT、APX和 POD 的活性，提高抗氧化物质Car和Pro的含量，降低了O2-·的生成速率，H2O2和MDA 的含量。说明ALA在低浓度下可以促进黄瓜叶片光合色素的合成，增加黄瓜的抗氧化能力，这与前人研究ALA在油菜、番茄、辣椒等植物上施用效果的结果是一致的[14～16]。

ALA对植物生长发育调节作用的效果与ALA的施用浓度和作物种类密切相关，若ALA的浓度使用不当，则调节作用效果减弱，并能对作物生长造成过氧化的伤害[14，17，18]。Zhang等[14]研究表明1 mg/L ALA可以促进油菜的生长，而50 mg/L ALA诱导油菜体内过氧化物质积累，延缓植株的生长。100～400 mg/L ALA喷施红掌幼苗叶片，可显著增加叶绿素的含量，促进幼苗的生长，并以ALA300 mg/L处理效果最佳[17]。即使在同一种作物上，ALA施用效果也存在着很大的差异[2～4]。本研究发现ALA对黄瓜品种津春4号幼苗的施用效果并不是和ALA的施用浓度成正比，而是存在一个最佳施用浓度，30 mg/L ALA施用效果最明显。当ALA的浓度达到100 mg/L时，黄瓜叶片内的活性氧增加，脂膜过氧化程度增加，叶绿素含量降低，叶片颜色变浅，这可能是与ALA在高浓度下，一方面直接启动细胞过氧化反应，生成如 O2-·、H2O2和·OH等活性氧自由基，另一方面ALA代谢合成叶绿素和血红素要经过一些的酶促反应，其中在黑暗条件，ALA可以转化并积累光敏性很强的物质——原卟啉原IX或者原卟啉IX，这些物质如果黑暗中积累过量，再遇光，则诱发单线态氧，导致细胞的过氧化反应，伤害甚至杀死细胞[14，18]。因此在生产上推广应用ALA，其施用方法和浓度必须按照植物的品种特性、施用时期和ALA的纯度等进行严格的筛选，才能达到最佳的施用效果。

综上所述，喷施ALA增强了黄瓜品种津春4号的光合色素的合成能力和抗氧化能力，降低O2-· 生成速率，抑制膜脂过氧化的产生；黄瓜叶面喷施ALA的浓度不宜过高，30 mg/L ALA即可达到最佳的施用效果。

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