双水相萃取分离稻壳黄酮的工艺研究*

苏学军，王 艳，高荣荣

（泰州职业技术学院 药学院，江苏 泰州 225300）

双水相萃取分离稻壳黄酮的工艺研究*

苏学军，王 艳，高荣荣

（泰州职业技术学院 药学院，江苏 泰州 225300）

以浓缩后的稻壳粗提液为原料，采用乙醇/硫酸铵双水相体系对稻壳黄酮分离纯化，以确立双水相萃取稻壳黄酮的工艺参数。通过单因素试验法探讨了硫酸铵质量分数、乙醇质量分数、粗提液加入量、温度、pH值对稻壳黄酮萃取效应的影响，并以萃取率为考察指标，正交实验法优选出最佳萃取工艺条件。结果表明，在自然pH值及45℃条件下，当乙醇质量分数为29%、硫酸铵质量分数为18%、粗提液加入量为3mL时，稻壳黄酮萃取率达96.26%。此法条件温和，操作简便，可作为从稻壳粗提液中分离纯化稻壳黄酮的一种有效手段。

稻壳；双水相体系；黄酮；乙醇/硫酸铵

前 言

黄酮类化合物是具有多种生物学活性的天然多酚类物质，有明显的抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药理及保健作用[1，2]。因其来源广泛，安全无毒，在农业生产中可开发为植物源农药、植物生长调节剂及饲料添加剂[3，4]；在食品工业常用作天然甜味剂、保鲜剂、油脂抗氧化剂、天然色素或作为功能性保健食品的添加剂[5]，极具开发应用前景。

稻壳是传统意义上的农业废弃物，目前对稻壳资源的利用主要是燃烧发电或制备无机精细化工产品二氧化硅和活性炭。为实现稻壳资源的高值化利用，可将其中的黄酮类化合物进行提取和分离。稻壳黄酮的提取方法主要有溶剂浸提法、超声波提取法、微波辅助提取法和酶解法等[6]。不同提取法得到的黄酮粗提液一般需要经过浓缩、分离纯化、干燥等精制工艺处理，才有实际应用意义。黄酮粗提液最常用的分离纯化方法主要是液-液萃取法和大孔吸附树脂法。液-液萃取法的生产能力大、时间短，但有机溶剂残留多[7]。用大孔吸附树脂法进行纯化，虽选择性好、纯度高，但树脂的预处理过程繁琐，吸附洗脱时间长[8]。双水相萃取是一种高效温和的绿色生物分离技术，具有操作简单、过程易放大、分相速度快、选择性好、易保留生物活性等优点，被广泛应用于食品、生物及医药等领域[9，10]。本实验选用乙醇/硫酸铵双水相体系分离纯化稻壳黄酮，采用单因素试验法和正交实验法分析了目标萃取物在双水相体系中的分配行为，确定了双水相萃取稻壳黄酮的最佳工艺条件,以期为稻壳废弃物的综合利用提供技术支持。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

稻壳产自江苏省泰兴市、芦丁标准品,上海伊卡生物技术有限公司、无水乙醇、三氯化铝、氢氧化钠、盐酸、硫酸铵均为市售分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

TU-1810紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；sartorius电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；XA-1微型高速粉碎机，姜堰市银河仪器厂；KQ5200DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；80-2台式离心机，上海浦东物理光学仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市科华仪器设备有限公司；RE52-99旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 稻壳黄酮粗提液的提取

稻壳去杂、洗净、烘干，粉碎后过40目的筛。精确称取10g稻壳微粉,加入40mL的石油醚浸泡48h，过滤，烘箱内低温挥尽石油醚，然后按1∶30（g/mL）的料液比加入质量分数为50%的乙醇溶液，置30℃恒温水浴振荡器中振荡浸渍处理1h，再于60℃下超声提取0.5h，趁热过滤，滤渣以同样方法再次超声提取并抽滤，合并滤液。滤液过0.45μm的微孔滤膜，经减压浓缩回收乙醇至无醇味后，加水溶解并定容于100mL容量瓶内，即得稻壳黄酮粗提液，低温保存备用。

1.2.2 乙醇/硫酸铵双水相体系的形成

在50mL烧杯中加入一定量硫酸铵，将其置于25℃恒温水浴中，加入蒸馏水溶解，磁力搅拌下缓慢滴加无水乙醇，观察体系变化，至溶液刚好出现浑浊时，记录乙醇的加入量。然后向体系滴加蒸馏水，溶液澄清，记录水的加入量。继续滴加乙醇，再次出现浑浊，如此反复操作。计算出每次浑浊时乙醇、硫酸铵的质量分数，并绘制乙醇/硫酸铵双水相相图。

1.2.3 双水相体系萃取稻壳黄酮

依据乙醇/硫酸铵双水相相图，在两相区选取合适的双水相萃取体系。设计双水相系统总质量为20g，在25mL具塞刻度管中加入一定量的乙醇、硫酸铵及适量体积的稻壳黄酮粗提液，余补足蒸馏水。充分振荡摇匀，于恒温水浴中静置，直至完全分相后，读出上、下相体积。吸取上、下相溶液适量进行分析，采用AlCl3比色法[11]测定黄酮含量，并通过相比（R）、分配系数（K）及萃取率（Y）考察稻壳黄酮在双水相体系中的分配行为，计算公式如下：

式中，Vi、Vj分别为上、下相体积（mL）；Ci、Cj分别为上、下相稻壳黄酮的质量浓度（mg/mL）。

2 结果与讨论

2.1 乙醇质量分数对稻壳黄酮萃取率的影响

在25℃，粗提液加入量为2mL，硫酸铵质量分数为17%的双水相体系中，加入不同质量分数的无水乙醇，考察对稻壳黄酮的萃取效果，结果见图1。

图1 乙醇质量分数对萃取率的影响Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate

由图1可见，当硫酸铵质量分数一定时，萃取率随着乙醇质量分数的增加而增大，当乙醇的质量分数增加到27%时，萃取变得平衡。这是因为黄酮类化合物具有一定的醇溶性，随着双水相体系中乙醇质量分数的增大，目标萃取物和溶剂的接触面积变大，使得其在富含乙醇的上相中有较大的分配系数。但当乙醇质量分数进一步增大时，会造成相比过大，上相体积过多，反而不利于黄酮的富集。综合考虑，合适的乙醇质量分数选择27%即可。

2.2 硫酸铵质量分数对稻壳黄酮萃取率的影响

在25℃，粗提液加入量为2mL，乙醇质量分数为27%的双水相体系中，加入不同质量分数的硫酸铵，考察对稻壳黄酮的萃取效果，结果见图2。

由图2可见，在成相浓度范围内，萃取率随硫酸铵质量分数的增加而增大，在质量分数为18%时达到了最大值。这是因为硫酸铵质量分数的增大，其水合能力增强，导致下相体积增大，极性增强，稻壳黄酮在下相的溶解度减小。上相中水的减少，使得乙醇浓度相应地增大，因而上相中黄酮的溶解度增大，分配系数和萃取率随之增大。实验发现，当硫酸铵质量分数超过20%时，双水相体系中硫酸铵浓度已达饱和，出现盐析现象，反而影响了黄酮的浸出，故合适的硫酸铵质量分数选择18%。

图2 硫酸铵质量分数对萃取率的影响Fig.2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on extraction rate

2.3 粗提液加入量对稻壳黄酮萃取率的影响

在25℃，乙醇质量分数为27%，硫酸铵质量分数为18%的双水相体系中，考察粗提液加入量对稻壳黄酮的萃取效果，结果见图3。

图3 粗提液加入量对萃取率的影响Fig.3 Effect of mass fraction of crude extract on extraction rate

由图3可见，当乙醇和硫酸铵质量分数一定时，随双水相体系中粗提液加入量的增多，萃取率呈先快速上升后缓慢下降趋势。粗提液加入量会影响盐的溶解度，进而影响分配行为和萃取率。因而，合适的粗提液加入量选择2mL。

2.4 pH值对稻壳黄酮萃取率的影响

在25℃，粗提液加入量为2mL，乙醇质量分数为27%，硫酸铵质量分数18%时，考察不同pH值体系对稻壳黄酮的萃取效果，结果见图4。

由图4可见，当双水相体系一定时，萃取率随着溶液pH值升高快速增大，至pH值=5时，萃取变得平衡。对于乙醇/硫酸铵双水相体系而言，上相电位为正，下相电位为负。稻壳黄酮为一种C-糖苷类物质[11]，分子结构中含多个羟基，不同pH值条件会影响其表面的电荷性。随着双水相体系pH值的降低,体系中H+数量增多，黄酮能结合更多的H+而带正电荷，会朝电位为负的下相富集，从而导致萃取率的降低[12]。就整个双水相体系而言，当pH值控制在5～7范围内，pH值的变化对萃取率的影响较小，而双水相体系的自然pH值则在此范围内，基于经济性及易操作性，选择自然pH值条件进行操作即可。

图4 pH值对萃取率的影响Fig.4 Effect of pH value on extraction rate

2.5 温度对稻壳黄酮萃取率的影响

在25℃，粗提液加入量为2mL，乙醇质量分数为27%，硫酸铵质量分数18%时，考察不同温度对稻壳黄酮的萃取效果，结果见图5。

图5 温度对萃取率的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

由图5可见，当温度低于45℃时，随着温度的升高，稻壳黄酮的萃取率不断变大，但当双水相体系温度进一步升高时，萃取率呈明显下降趋势。这可能由于温度的升高，使得相际之间传质速率加快，加速了水溶性多糖、蛋白质等杂质向下相富集[13]，黄酮向上相富集，因而萃取率变大。但温度过高也能增强溶质的扩散作用，进而影响黄酮在上相的分配比，造成萃取率下降。此外，温度越高硫酸铵的溶解度越大，降低了双水相系统的分相能力，当温度高于75℃时，相界面已模糊，故合适的温度选择45℃为宜。

2.6 双水相萃取稻壳黄酮正交优化实验

在单因素分析基础上，按表1设计L9（34）正交表。以稻壳黄酮的萃取率Y作为评价指标考察双水相的萃取效果，确定萃取最优工艺条件，正交试验结果与分析见表2。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，在实验所选的水平内，各因素对双水相体系萃取稻壳黄酮的影响关系为C＞A＞B＞D，以粗提液加入量对黄酮萃取率的影响最大，温度的影响则最小。直观分析可得最佳萃取条件为A3B2C3D2，即温度45℃，乙醇、硫酸铵质量分数分别为29%、18%，粗提液加入量为3mL。在此条件下，进行了5次验证实验，结果显示平均萃取率为96.26%。

3 结论

乙醇/硫酸铵双水相体系中两相的极性差异直接影响着稻壳黄酮的分配行为，在自然pH值及45℃条件下，用质量分数为29%的乙醇及质量分数为18%硫酸铵双水相体系，从添加量为3mL的稻壳粗提液中萃取稻壳黄酮的萃取率为96.26%。该法操作简单，条件温和，过程易放大，可作为一种稻壳黄酮分离纯化的有效方法。

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Research on the Separation of Rice Hull Flavonoids by Aqueous Two-phase Extraction

SU Xue-jun,WANG Yan and GAO Rong-rong
（College of Pharmacy,Taizhou Polytechnic Institute,Taizhou 225300,China）

In order to establish the technological parameters of the extraction of rice hull flavonoids,the separation of flavonoids from the concentrated crude extract of rice husk by aqueous two-phase system of ethanol/ammonium sulfate was studied.Factors of mass fraction of ammonium sulfate,mass fraction of ethanol,adding amount of crude extract,temperature and pH value on the extraction of flavonoids were investigated by single factor analysis,and the optimum extraction condition was determined by the orthogonal test method with the extraction rate as the index.The results showed that the optimum phase composition was the ethanol mass fraction 29%，ammonium sulfate mass fraction 18%and the amount of crude extract of 3mL at natural pH and 45℃,the extraction rate of flavonoids was up to 96.26%.Therefore,the method is mild and easy to operate,and can be used as an effective method for separating and purifying flavonoids from the crude extract of rice hull.

Rice husk；aqueous two-phase system；flavonoids；ethanol/ammonium sulfate

TS914.1

A

1001-0017（2017）05-0356-04

2017-03-17 *基金项目：泰州市科技支撑计划社会发展项目（编号：SSF20140087）；江苏省大学生创新创业训练计划资助项目（编号民：201512106014X）。

苏学军（1974-），男，江苏泰兴人，副教授，硕士研究生，主要从事天然产物活性成分的提取与分离研究。