婴幼儿食品生产环境中阴沟肠杆菌的分离鉴定及其PFGE溯源分析

林学海,林文珍,陈远哲,黄聪辉,王伟军,肖功年

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,杭州 310023;2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司,温州 325800;3.浙江一鸣食品股份有限公司,温州 325499)

婴幼儿食品生产环境中阴沟肠杆菌的分离鉴定及其PFGE溯源分析

林学海1,林文珍2,陈远哲1,黄聪辉1,王伟军3,肖功年1

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,杭州 310023;2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司,温州 325800;3.浙江一鸣食品股份有限公司,温州 325499)

通过对婴幼儿食品生产环境中可能存在的阴沟肠杆菌污染点进行取样,共分离得到了30株菌株,16S rRNA鉴定结果表明有15株为阴沟肠杆菌,在检出菌株中占50%,且分布较为广泛,在成品区域检出率高达80%.同时,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对15株阴沟肠杆菌进行了溯源分析,发现生产环境可能成为阴沟肠杆菌二次污染源,原料样品中污染的阴沟肠杆菌经过一系列工序加工后,仍然存在于后续半成品或成品中.

阴沟肠杆菌;婴幼儿食品;PFGE分型技术

0 引言

阴沟肠杆菌[1](Enterobacter cloacae,ECL)是革兰氏阴性杆菌,属肠杆菌科肠杆菌属细菌,由于该菌普遍存在于人和动物的肠道中,可引起败血症、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病,也能引起食源性疾病,因此常常被当作条件致病菌的代表.2004年4月,联合国粮农组织和世界卫生组织建议将其代替大肠菌群作为评价婴儿配方奶粉安全性的卫生指标[2].

脉冲场凝胶电泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis,PFGE)是一种细菌分子分型技术,以电场作为引导力,对利用稀有切点的限制性核酸内切酶进行酶切产生大小不同的DNA片段进行分离[3].PFGE分型技术可鉴别菌株间的亲源性,分析各菌样的流行相关性,追溯污染源,从污染途径或污染源对污染微生物进行控制,被认为是微生物分子分型技术的quot;金标准quot;[4].

1 实验

1.1 材料与设备

材料:肠道菌增菌肉汤(EE肉汤),胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA),细菌基因组DNA提取试剂盒,蛋白酶K,Xba I酶.

仪器:全自动细菌鉴定及药敏分析系统(VITEK®2-Compact),VITEK革兰阴性鉴定卡,9700 PCR扩增仪,DYY-10C型电泳仪,BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统,HC-2062高速离心机,DKZ-1电热恒温振荡水槽,ATB比浊器,Fe20k型pH计,水平电泳槽,垂直电泳槽,SHP-150生化培养箱.

1.2 方法

1.2.1 取样与菌种鉴定

根据婴幼儿食品生产流程,对可能存在的微生物污染点进行涂抹取样,将得到的样品参照《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第7部分:阴沟肠杆菌检验》(SN/T 2552.7)进行培养和筛选[5],挑选疑似菌落进行生理生化鉴定.将初步鉴定的菌株利用16S核酸全序列检测技术以鉴定其所属及种,再进行相关实验.

1.2.2 PFGE实验

阴沟肠杆菌PFGE分型方法主要参考美国PulseNet PFGE标准化分型方法[6],对分离得到的阴沟肠杆菌进行PFGE分型实验,具体步骤如下:

(1)制胶.将实验用菌株接种到TSA上,37℃过夜培养,将菌苔转移至有细胞悬浮液(CSB)的Falcon管中,调节OD值为4.0~4.5,取制成的菌悬液400 μL转移至1.5 mL离心管中,每管加入20 μL质量浓度为20 mg/mL的蛋白酶K混匀,使其最终质量浓度为0.5 mg/mL.加入55℃预热的含1%Seakem Gold:1%SDS的低熔点琼脂糖400 μL,混匀加入模具加样孔中,室温下凝固15 min.

(2)胶块裂解.在50 mL聚丙烯螺帽管中加入:5 mL细胞裂解液(CLB)和20 mL蛋白酶K.将胶块移入相应管中,做好标记,放入54℃水浴摇床中,水浴4 h,转速60 r/min(不宜过快).用去离子水(DDH2O)清洗4次,10~15 min/次,再用TE缓冲液清洗2次,10~15 min/次.

(3)胶块内DNA酶切.用刀片切下2~2.5 mm宽的胶块,放入含酶切稀释液的1.5 mL微量离心管中,37℃水浴中孵育5-10 min,或室温10~15 min.将胶块转入含10 U/μL Xba I酶的酶切体系中,37℃水浴中酶切至少2 h.

(4)电泳.将酶切后的胶块置于梳齿上,从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的经55~60℃平衡的1%SKG,在室温下凝固30 min左右,记录加样顺序.将凝固的胶块加入盛有2.2 L 0.5X TBE缓冲溶液的电泳槽中,开始电泳.电泳条件:14℃、分子量30~700 ku,脉冲时间2.16~63.8 s,电泳时间18~19 h.

(5)拍照和结果分析.电泳结束后,取出胶,放在盛放400 mL的Gelred溶液托盘内,染色20~30 min.以500 mL纯水脱色每20~30 min换1次DDH2O,脱色4次.用BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统拍摄图像.

1.2.3 PFGE条带分析

利用Quantity one TM软件提取PFGE图谱,电泳图谱用沙门菌H9812作为统一的分子量标准进行校准,用BioNumerics V6.6软件(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean,UPGMA)方法进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 取样与菌种鉴定

根据SN/T 2552.7[5]取样方法,对婴幼儿食品生产环境中可能存在的污染点取样,分离得到了30株菌株,经16S rRNA鉴定得到的结果,如表1所示.

表1 生产车间微生物分离鉴定结果

从婴幼儿食品生产环境中分离鉴定出的30株菌株(表1),经过16S rRNA鉴定,这些菌分属于10个种,其中7个种均分属于肠杆菌科,分别为阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、非脱羧勒克菌、弗氏柠檬酸杆菌、无色杆菌、霍氏肠杆菌和赫氏埃希氏菌,而其中主要检出菌为阴沟肠杆菌,共检测出了15株,在检出菌株中占50%.

由表1可以看出,阴沟肠杆菌分布较为广泛,在原料区域、生产区域和成品区域均有检出,在成品区域检出率最高,结果高达80%.婴幼儿食品生产过程中由于外界因素如人、原料以及环境等都会带入微生物进而污染产品.

取样方法以SN/T 2552.7为标准,将得到的微生物进行16S rRNA鉴定,鉴定结果大部分为肠杆菌科,未检测出阪崎克罗诺杆菌.一方面说明阪崎克罗诺杆菌在生产过程中较少,对于最终产品生产较为有利;另一方面肠杆菌科较多说明食品生产环境中微生物控制还需要加强.

2.2 PFGE分型溯源分析

将分离鉴定的15株阴沟肠杆菌利用PFGE分型技术进行溯源分析,阴沟肠杆菌基因组DNA片段得到良好分离,产生15~26条DNA片段,酶切条带分子量范围为20~1 200 kb,其中主要酶切条带集中在30~700 kb,见图1.

图1 阴沟肠杆菌聚类分析图谱

聚类图使用非加权配对算数平均法UPGMA构建,条带位置差异容许度和优化度分别设为1.00和0.50.以数值为相关性大小判定,规定将相似度≥50%者归为同一型别PFGE基因指纹图谱,相似度≥70%者归为同亚型PFGE基因指纹图谱,相似度≥99%者归为同一菌株PFGE基因指纹图谱.

根据分析结果可确认2和3菌株与其他阴沟肠杆菌属于不同型别PFGE基因图谱,说明菌株间相关性不大,是不同型别的阴沟肠杆菌.

菌株6,7,8相似性为84%;菌株10,11,12相似性为76%;菌株13,14,15,16相似性为87%;表明这三组菌株各分属于不同阴沟肠杆菌菌株,即每组内菌株为同一压型菌株.从样品来源结合菌株PFGE基因图谱分析,菌株6,7,8分别来源于畚斗、大米车间传送带挡板和包装机表面;这些地方可能是二次污染的污染源,需要在生产过程中注意进行清洁处理.菌株10,11,12分别来源于鱼肉高蛋白粉大包料表面、干燥之后半成品和米粉半成品1,可判断该米粉半成品污染源可能为外来原料或生产环境.菌株13,14,15,16分别来源于大米原料、米粉后混机、米粉半成品2和米粉成品1,菌株间相似性高达87%,可判断此4株阴沟肠杆菌为同一菌株,污染途径为从大米原料开始,随着米粉混料工艺和后混工序,最后污染米粉产品,大米原料为产品污染的污染源.

3 讨论

阴沟肠杆菌由于其普遍性和危害性而一直受到人们的关注,有调查发现[7],阴沟肠杆菌在奶粉中的检出率高达21.3%,且分离出了与侵袭性大肠杆菌相同抗原的阴沟肠杆菌.此次分离与鉴定结果显示,在婴幼儿食品生产环境中虽未发现阪崎克罗诺杆菌,但阴沟肠杆菌污染情况较为严重,在原料区域、生产区域和成品区域均有检出,因此对于阴沟肠杆菌的检测和控制具有重要的实际意义.

起初,阪崎克罗诺杆菌被误认为是阴沟肠杆菌的生物变型菌,并被命为quot;黄色阴沟肠杆菌(yellow-pigmented Enterobacter cloacae)quot;,直到1980年,Farmer等[8]对收集的57株阪崎克罗诺杆菌进行DNA杂交、生化反应、黄色菌落产物以及抗生素敏感性等一系列实验,结果发现quot;黄色阴沟肠杆菌quot;与阴沟肠杆菌虽在生化反应上相似,但quot;黄色阴沟肠杆菌quot;在培养2-7 d左右D-山梨醇反应为阴性,胞外DNA酶反应阳性,并且产生黄色菌落、对氨苄青霉素和头孢菌素非常敏感,这些都与阴沟肠杆菌不同,为此Farmer等建议将quot;yellow-pig⁃mented Enterobacter cloacaequot;更名为quot;Enterobacter sakaza⁃kiiquot;.此名称被广泛地采纳,并沿用至今.

目前国内针对阴沟肠杆菌的研究报道并不多,主要集中在其耐药基因、耐药机制和临床分布方面[9,10],对阴沟肠杆菌在婴幼儿食品分离鉴定和溯源分析方面未见新的报道.采用传统的检测方法虽能满足检测的需求,但难以体现出菌样本身的代表性,不能准确推测出其在生产环境中的流行相关性,此外,传统检测方法往往会出现假阳性和假阴性的现象.林学海等[11]报道指出PFGE分型技术作为食品生产过程中快速检测与监测技术,可分析菌样间的亲源性和流行相关性,从而追溯污染源,实现在此基础上采取适当措施控制污染源.此次对于阴沟肠杆菌PFGE溯源分析可发现生产环境可能成为二次污染的污染源,原料中的阴沟肠杆菌经过一些列生产工艺后依然存在于后续半成品或成品中,成为生产污染源,分析结果表明PFGE分型技术能够分析菌株之间的遗传差异和相关性.Masaki等[12]以PFGE分型技术证实了用来清洗玻璃瓶的刷子被克罗诺杆菌感染后,成为了3例病例的感染来源.柴云雷等[13]对分离自不同来源的10株阪崎克罗诺杆菌分别进行16S rDNA全序列检测和PFGE分型分析,发现PFGE的分型分析能力明显优于16S rDNA全序列检测.对生产过程中可能存在的微生物污染点进行取样检测,通过PFGE分型技术,及时监测污染源或污染点,分析样品间可能存在的联系,针对性采取恰当措施,进而避免微生物爆发式污染产品;同时也可用于对已确认的爆发污染进行污染源或者污染途径溯源追踪,从而有效预防微生物污染的再次发生.

4 结论

(1)从婴幼儿食品生产环境中分离鉴定了30株菌株,其中15株为阴沟肠杆菌,在检出菌株中占50%,且分布较为广泛,在成品区域检测率高达80%,结果表明,虽未检测出阪崎克罗诺杆菌,但阴沟肠杆菌污染情况较为严重.

(2)对15株阴沟肠杆菌利用PFGE分型技术进行溯源分析,发现生产环境可能成为阴沟肠杆菌二次污染源,原料中的阴沟肠杆菌经过一些列工艺后依然存在于半成品或成品中,成为生产污染源.

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Strain identification and PFGE tracing analysis of Enterobacter cloacae in the environment of infant food production

LIN Xuehai1,LIN Wenzhen2,CHEN Yuanzhe1,HUANG Conghui1,WANG Weijun3,XIAO Gongnian1
(1.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang provincial Key Lab for Chemamp;Bio Processing Technolo⁃gy of Farm produces,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,China;2.Zhejiang Panda Dairy Co.Ltd.,Wenzhou 325800,China;3.Zhejiang Yiming Food Co.,Ltd,Wenzhou 325499,China)

This paper samples the possible contamination of Enterobacter cloacae in the environment of infant food production.As a result,30 strains were isolated and 15 strains were identified to be Enterobacter cloacae by the technology of 16S rRNA which were accounted for 50 per⁃cent in the quantity of isolated of 30 strains.Moreover,the distribution of strains of Enterobacter cloacae are extensive,the isolated-rate even up to 80 percent in the finished product area.Simultaneously,15 strains of Enterobacter cloacae were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE),it was concluded that the production environment may become secondary sources,and the contaminated raw material of Enterobacter cloacae will still exists in the follow-up semi-finished or finished products after a series of processing.

Enterobacter cloacae;infant food;PFGE typing technology

Q93-331

A

1001-2230(2017)10-0011-03

2017-02-23

浙江省重大科技专项重大农业项目(2014C02012);浙江省自然科学基金项目(LY14C200007);杭州市科技计划项目(20140432B106).

林学海(1991-),男,硕士研究生,从事乳品微生物控制研究.

肖功年