产β-葡萄糖苷酶细菌的筛选及转化白藜芦醇的研究

冯薇 胡小妍 马明娜 郭萌 路福平 李玉

（天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457）

产β-葡萄糖苷酶细菌的筛选及转化白藜芦醇的研究

冯薇 胡小妍 马明娜 郭萌 路福平 李玉

（天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457）

白藜芦醇具有抗癌、抗氧化等八大功效，在医药、化妆品等领域应用广泛。为获得分泌β-葡萄糖苷酶的细菌菌株，并实现其对虎杖苷的有效转化。通过栀子苷平板初筛、虎杖苷摇瓶复筛，筛选得到一株能够分泌β-葡萄糖苷酶，转化虎杖苷生成白藜芦醇的菌株，并利用16S rDNA序列对筛选得到的菌株进行鉴定，鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），命名为CGMCC 13129，该菌株在37℃，接种量为7%，底物虎杖苷浓度为0.1%，pH为7，转化8 h的条件下，对底物虎杖苷的转化率可达90%以上，利用HPLC、HPLC-MS、1H-NMR等手段检测转化产物为白藜芦醇，经甲醇萃取一次，纯度高达99.3%。

白藜芦醇；沙福芽孢杆菌；β-葡萄糖苷酶；虎杖苷

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚物质，化学名称为芪三酚，分子式为C14H12O3，无色针状结晶，熔点256-258℃，较难溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，光、热稳定性差。广泛存在于蓼科、葡萄科等70多种植物中。它具有良好的治疗阿尔茨海默病、清除易形成聚集体的病理性蛋白、保护心血管系统、抗抑郁及神经保护、抑制肿瘤恶性增殖［1-5］等功效。因其可应用于保健品、化妆品、医药等行业而受到人们的关注。

白藜芦醇的生产方式主要包括植物提取法、化学合成法和生物转化法。张景亚等［6］优化超声提取花生衣中白藜芦醇的工艺，使其平均提取率达0.3%。Guiso 等［7］利用3，5-二乙酰氧基苯乙烯与对乙酰氧基碘苯发生Heck 反应，水解得到白藜芦醇，总产率达70%。Solladie 等［8］应用Perkin 反应以对异丙氧基苯乙酸和3，5-二异丙氧基苯甲醛为原料，获得单一顺式构型白藜芦醇，经异构化、脱除保护基得反式白藜芦醇，总收率达55.2%。碳负离子与羰基发生亲核加成反应［9］，所得的烃基消除后可以形成双键，合成路线步骤较繁琐，但是该方法利于构型选择。生物转化法中，田天丽等［10］用根霉与中药虎杖共发酵的方法获得产物白藜芦醇；白藜芦醇酶法提取条件温和，提高原料利用率和产物得率，但成本较高。一般采用多种酶复合，应用较多的是糖苷酶和纤维素酶。黄志芳等［11］用纤维素酶将虎杖中的虎杖苷酶解成白藜芦醇，使白藜芦醇得率比醇提法提高近5倍。

植物中游离的白藜芦醇极少，约为0.01%，多结合葡萄糖以苷（虎杖苷）的形式存在；因此从植物中提取白藜芦醇的收率不高。白藜芦醇的光热不稳定性，又限制了化学合成法在白藜芦醇生产中的应用。真菌转化虎杖苷的时间较长，且不便于产物的分离纯化。利用酶法水解，效率稍有提高，但成本也非常高。β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的 β-D- 葡萄糖苷键，同时释放出 β-D-葡萄糖和相应的配基［12］，虎杖苷可被β-葡萄糖苷酶水解为白藜芦醇。利用能够分泌β-葡萄糖苷酶的菌株转化虎杖苷生成白藜芦醇有效可行，且开发一种转化时间短，反应条件温和，转化率高的生产白藜芦醇的方法尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 采自湖北省随州市常年种植虎杖的土壤。

1.1.2 主要试剂和仪器 甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），白藜芦醇标准对照品（98%）、栀子苷（50%）、虎杖苷（50%）均购自南京狄尔格医药公司。PTC-200型PCR基因扩增仪（MJ Research Inc.）、高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18）、旋转蒸发仪（瑞士buchi）。

1.1.3 培养基 筛选培养基：纯度为50%的栀子苷3 g/L，精氨酸 2 g/L，tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂20 g/L；种子培养基：精氨酸2 g/L，tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L；转化培养基：牛肉膏5 g/L，tryptone 10 g/L，NaCl 5 g/L，纯度为50%的虎杖苷1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌种采集与分离纯化 用生理盐水冲洗虎杖根，浸泡摇匀后，梯度稀释，分别涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素、0.3%的栀子苷的固体培养基上和含有0.3%的栀子苷的LB固体培养基上，栀子苷与β-葡萄糖苷酶反应发生明显的蓝色变化［13］，观察菌落生长情况，编号记录。

1.2.2 底物转化及产物的提取与精制 挑取单菌落，接入种子培养基中，培养至对数期后转接入转化培养基中，37℃。220 r/min，摇瓶转化培养。将完成转化的发酵液离心后，弃去上清，向沉淀中加入甲醇，再次离心后取上清，弃去沉淀，利用旋转蒸发仪将甲醇蒸出，得到产物白藜芦醇。

1.2.3 转化产物检测与含量分析 利用HPLCMS检测的方法为：流动相为乙腈∶水∶甲酸=40∶59.94∶0.06；色谱柱：GRACE Vydac 218TPC18；检测波长：306 nm；柱温：35℃。利用1H-NMR（400 MHz）检测参照 Christian S 等［14］的方法，氘代丙酮（C3D6O）溶解产物干燥粉末样品。利用HPLC检测的方法为：流动相为乙腈∶水∶磷酸=40∶59.82∶0.18；色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18；检测波长：306 nm；柱温：35℃。配制1 mg/mL白藜芦醇溶液，利用高效液相测定白藜芦醇在进样量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL时的峰面积，得到白藜芦醇标准曲线，结果见图1白藜芦醇浓度与峰面积关系标准曲线。

图 1 白藜芦醇浓度与峰面积的关系（Y=0.380 5+6.665 5X，R=0.996 28）

2 结果

2.1 菌株的筛选与鉴定

利用1.2.1中所述的方法，筛选得到一株能够分泌β-葡萄糖苷酶的菌株CGMCC 13129，因β-葡萄糖苷酶可水解固体培养基中的栀子苷，生成生产蓝色络合物京尼平，在菌落周围出现了明显的蓝色，如图2所示，证明该菌株能够分泌β-葡萄糖苷酶。菌株经革兰氏染色呈阳性、短杆状、有芽孢，芽孢中生、不膨胀，属于典型的芽孢杆菌属形态特征，其个体形态如图3所示。

图 2 菌株在初筛平板上的菌落形态

图3 菌株的个体形态（100×10）

通过PCR获得16S rDNA序列，经测序，分析其大小为1 373 bp，利用NCBI数据库进行对比分析，结果表明该菌与芽孢杆菌属的多个沙福芽孢杆菌具有99%以上的同源性。系统进化树如图4所示。综合菌株的16S rDNA序列分析，确认该菌株为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），保藏编号为CGMCC 13129。

2.2 利用沙福芽孢杆菌转化虎杖苷生产白藜芦醇

利用1.2.2中所述方法，将种子液接入发酵培养基中，接菌前培养基澄清，如图5所示。接菌后进行摇瓶培养，随着菌体大量生产繁殖，培养基变得浑浊；摇瓶培养8 h后，有明显的团状沉淀出现，上清液中菌体浓度明显降低，如图6所示，产物难溶于水在液体培养基中结晶析出，摇瓶底部出现大量白色沉淀。

图 4 菌株的系统进化树

图 5 接种B.safensis菌前的培养液

图 6 接种B.safensis菌后转化8 h的培养液

2.3 底物浓度与转化时间对转化结果的影响分析

利用1.2.2中所述方法对虎杖苷进行转化，分别对底物浓度和转化时间进行优化，由图7可知，当底物虎杖苷浓度为0.1%时转化率较高，为90%左右；当底物虎杖苷浓度为0.2%时，转化率趋近于0%。随着底物虎杖苷浓度增加，转化率迅速降低，底物浓度过高影响菌体生长繁殖，而导致底物几乎不被转化。由图8可知，当转化时间为8 h时，转化率较高，短于或长于8 h，转化率均降低；6 h时因未完全转化导致测得的转化率较低，而转化时间过长，产物白藜芦醇被降解，导致转化率下降，朱屹东［15］也分析了类似的问题，利用沙福芽孢杆菌转化虎杖苷8 h，转化率就能达到90%，可大大缩短转化时间，显著降低白藜芦醇的工业化生产成本。

图 7 底物浓度与转化率的关系

图 8 转化时间与转化率的关系

2.4 产物的分析与检测

2.4.1 利用HPLC检测产物 利用1.2.3中方法检测转化产物，对比图9和图10可知转化产物与白藜芦醇标准品的出峰时间相同，产物经甲醇萃取一次，纯度可高达99.3%。

2.4.2 利用HPLC-MS检测产物的纯度 利用1.2.3中方法对产物纯度进行检测，白藜芦醇分子量为：228.25，分析图11及图12可知转化产物与白藜芦醇标准品分子量相同，确定转化产物为白藜芦醇，且纯度较高。

图9 白藜芦醇标准品HPLC图

图10 转化产物HPLC图

图 11 白藜芦醇标品HPLC-MS图

2.4.31H-NMR检测产物的结构 利用1.2.3中1H-NMR检测方法对产物结构进行检测，分析图13，1H-NMR（400 MHz，C3D6O）：δ 7.02（d，J = 16 Hz，1H），6.88（d，J = 16 Hz，1H），可知产物为反式白藜芦醇。

3 讨论

图 12 产物HPLC-MS图

图13 产物1H-NMR图

目前国内利用微生物转化法生产白藜芦醇的研究已较多，但主要集中在利用黑曲霉［16］、根霉菌［17］、酿酒酵母工程菌［18-21］等真菌转化，真菌转化耗时较长，需5-8 d左右，且不利于产物白藜芦醇的分离纯化。而关于细菌转化白藜芦醇的报道较少，国内朱屹东［15］构建了一株强化酪氨酸合成的白藜芦醇生产菌株，以葡萄糖为底物，最终白藜芦醇产量为71.6 mg/L，副产物主要有白藜芦醇二聚体和氧化白藜芦醇；本方法的产量是其方法的4倍且几乎无副产物。国外的研究中，Watts 等［22］以香豆酸作为底物，白藜芦醇产量为100 mg/L；Katsuyarnal 等［23］以香豆酰辅酶A为底物，白藜芦醇产量为171 mg/L Lim和Koffas 等［24］以对香豆酸为底物，白藜芦醇产量达到2.3 g/L。利用沙福芽孢杆菌转化底物虎杖苷生成白藜芦醇，转化率可达到90%以上，仅8 h即可完成一次转化。转化过程中，培养基由澄清变为浑浊，最后又变得较澄清。在显微镜下观察菌体和产物，发现大多数菌体被包含在产物内部，分析该现象出现的原因是产物白藜芦醇在转化过程中，以菌为晶核，因难溶于水而结晶析出。这个现象为后期产物的分离纯化提供了良好的先决条件，使得产物经一步甲醇萃取过程，纯度便可高达99.3%。

沙福芽孢杆菌分离自常年种植虎杖植物的土壤，而虎杖植物中虎杖苷的含量较低，自然条件下，菌株适应低浓度虎杖苷的环境，对底物虎杖苷的耐受能力较弱，高浓度底物虎杖苷对菌体生长繁殖影响较大，当底物虎杖苷浓度增加时，底物转化率显著下降，甚至无转化产物生成。综合考虑研究中出现的问题，对比构建高效的外源基因表达系统、细胞固定化与敲除底物浓度限制因素的基因等3种方法的优势与劣势，后续会考虑对沙福芽孢杆菌全基因组测序，改造其代谢途径，提高其对底物的耐受性，进一步提高底物的转化率。

4 结论

在肉汤培养基中，底物浓度为0.1%，接种量为7%，37℃，220 r/min摇瓶转化8 h，转化率高达90%以上。经甲醇萃取一次，纯度可高达99.3%；通过HPLC、HPLC-MS、1H-NMR检测确定产物为反式白藜芦醇。

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The Screening of β-Glycosidase-producing Strain and the Transforming of Resveratrol

FENG Wei HU Xiao-yan MA Ming-na GUO Meng LU Fu-ping LI Yu
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Resveratrol has a lot of benefits such as anti-cancer and anti-oxidation，and thus is widely applied in cosmetics，medicine and so on. This study aims to screen bacteria which can secrete β-glycosidase and study it’s ability of transforming polydatin. Through the geniposide plate screening and polydatin shake flask，a strain secreting β-glucosidase and transforming polydatin to resveratrol was acquired. It was identified as Bacillus safensis by 16S rDNA sequence analysis，named as CGMCC 13129. Under these conditions of 37℃，with 7 percent of inoculation，pH7，and conversing for 8 h，the conversion rate of polydatin was up to 90%. HPLC，HPLC-MS and1H-NMR were used to test and identify the product as resveratrol，and the purity of the product was up to 99.3% by one-time methanol extraction.

resveratrol；Bacillus safensis；β-glycosidase enzyme；polydatin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0439

2017-05-27

国家重点研发计划专项项目（2016YFD0400803）

冯薇，女，本科，研究方向：微生物与生化药学；E-mail：fengwei@mail.tust.edu.cn

李玉，女，教授，研究方向：应用微生物与酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn

（责任编辑 朱琳峰）