荜茇酰胺对胶质瘤细胞的影响

张倩 徐文茂

荜茇酰胺对胶质瘤细胞的影响

张倩 徐文茂

目的探讨荜茇酰胺（piperlongumine,PL）对胶质瘤增殖以及侵袭的作用并阐明其作用机制。方法我们应用荜茇酰胺处理了两种不同的人脑胶质瘤细胞系，并用正常神经元细胞和胶质细胞作为对照。通过检测PL对于细胞ROS水平的改变以及细胞增殖信号通路的改变。随后检测了PL潜在的作用靶点PRDX4的活性改变。结果PL能够显著增强两种人胶质瘤细胞的ROS水平以及抑制细胞增殖能力，但对正常神经元细胞则无明显影响。随后的检测中，我们发现PL刺激胶质瘤细胞后多种ROS相关的氧化反应调节因子都出现了上调，其中以PRDX家族中的PRDX4表达量上升最为明显。同时我们还发现，抑制ROS的作用之后，PL诱导胶质瘤细胞凋亡的能力出现了抑制。结论PL能够通过提高PRDX4的表达从而介导胶质瘤细胞的凋亡，因此PL可能作为胶质瘤的潜在治疗药物。

茇酰胺；胶质瘤；侵袭

作者单位：250022 济南，山东济南循证医药科技开发中心（张倩）；100054 北京，北京斯普林格医学研究院分子医学研究所（徐文茂）

高级别胶质瘤是中枢神经系统中恶性程度最高以及最为常见的肿瘤。其中，以胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）最为高发。尽管在临床以及实验室研究中都进行了大量的工作，但患者在诊断后的生存时间通常小于14.6个月，仅仅比25年前的生存期增加了2.5个月[1]。目前，最为有效的GBM治疗方法仅能短暂的增加患者的生存时间，而无法有效治疗肿瘤，并且仍存在着易复发和转移的特性，因此，新的GBM治疗方式急需创新。

通过以往的研究，我们发现大多数的GBM都存在PRDX4的过度高表达，同时，也有研究表明，通过敲除PRDX4能够增加ROS的表达量，进而在体外导致GBM细胞的凋亡，进一步在小鼠的原位GBM模型中，减少小鼠肿瘤体积，从而延长小鼠生存率。上述的研究都表明，通过靶向药物抑制PRDX4能够通过增加ROS的水平从而有效杀伤肿瘤细胞。

通过荜茇酰胺（piperlongumine,PL）选择性地增加ROS水平已被证明对许多肿瘤具有杀伤作用，包括乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤和GBM等[2]。PL是由植物荜茇中提取出来的天然生物碱。更为重要的是，应用PL的治疗方式在杀伤肿瘤细胞的同时，还能够减少对正常细胞生长的影响，减少化疗对机体的影响。以往的研究发现，药物处理后的肿瘤细胞中ROS水平出现了成倍的增长，而正常细胞则没有这种表现，表明PL具有肿瘤细胞靶向治疗的特性。过去的研究已经表明，PL的抗肿瘤作用与包括PRDX1的多种抗氧化蛋白密切相关[3]。更为重要的是，近期的研究表明，PL在全养分的培养条件下能够选择性的介导GBM的凋亡[4]。尽管如此，目前对于PL更为贴近临床的研究，即在胶质瘤癌球以及在体作用的研究仍不清楚，因此PL距离临床抗肿瘤药物的应用还存在研究的空间[5]。

在本研究中，我们发现PL处理后能够有效增加GBM细胞中ROS的水平，同时能够选择性的靶向介导HGG细胞的凋亡而对正常脑细胞无明显影响。究其机制，我们发现PL通过抑制胶质瘤细胞中PRDX4的活性而增加增加其内质网应激水平介导ROS的表达。

1 材料和方法

1.1 细胞系 人胶质瘤细胞系U87、U251均来源于上海细胞库。

1.2 药物处理以及细胞增殖能力检测 将5.0×103的细胞种于96孔板或3.0×104细胞种于24孔板，24 h后，用以不同浓度溶于DMEM的PL（0-10 μmol/L）处理细胞1 d-6 d，随后通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力改变。具体方法为分别在第1、2、4、6天加入10 μL的CCK-8试剂，37oC孵育2 h，测定 450 nm的OD值。

1.3 PRDX4活性检测 通过2-Cys-Peroxiredoxin活性检测试剂盒检测PRDX4的活性，具体方法为，30 μg细胞裂解液或者3 μg的重组人PRDX4蛋白与硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶以及NAPDH混合。随后加入10 mmol/L的过氧化氢启动反应并分别在第60、90、120秒通过分光光度法检测NADPH的消耗量。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 12.0 统计软件进行数据分析，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用卡方检验；计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PL处理后显著性介导胶质瘤细胞凋亡 我们首先应用不同浓度的PL分别对人胶质瘤细胞系以及正常的人胶质细胞以及神经元细胞进行了处理。结果发现，与未处理组相比，PL处理后的人胶质瘤细胞的增殖能力被有效的降低，其中，10 μmol/L的PL处理后，与正常培养的人胶质瘤细胞系相比较，能够将人胶质瘤细胞系U87、U251的增殖能力降低60%-90%，存在统计学差异。同时，通过对正常胶质细胞以及神经元细胞的处理我们发现，PL对于正常细胞的增殖能力无明显影响，PL处理后神经元的增殖能力未见明显变化，见图1。

2.2 PL处理后显著提高胶质瘤细胞中ROS的水平 随后，我们检测了PL对胶质瘤细胞的杀伤作用是否与其对其他肿瘤的机制类似，即通过增加ROS的水平从而介导肿瘤细胞的凋亡。通过检测后我们发现，在两组人胶质瘤细胞U87、U251中，给予PL刺激后，ROS水平分别增加了约51%和52%，而在神经元细胞刺激后则未见明显变化，见图2。上述结果表明，PL的肿瘤细胞杀伤作用与诱导肿瘤细胞内ROS水平上升相一致，为PL抗肿瘤作用的可能机制。

2.3 PL处理后能够选择性增加胶质瘤细胞的凋亡水平随后，我们有进一步检测了PL处理后，人胶质瘤细胞系U87、U251以及神经元细胞的凋亡水平，结果发现，PL处理后，U87以及U251的凋亡率均出现了显著增加，存在统计学差异，而应用PL处理神经元细胞后则未见其对神经元细胞的凋亡有明显影响，见图3。上述结果表明，PL能够通过提高胶质瘤细胞的ROS水平从而进一步介导胶质瘤细胞凋亡，但对正常的神经元细胞则无影响，表现出胶质瘤细胞的靶向治疗特性。

2.4 PL对于胶质瘤细胞的杀伤作用依赖于ROS的激活 同时，为了验证PL对于肿瘤细胞的杀伤作用依赖于ROS的增高，我们又在PL处理后的胶质瘤细胞系中加入了一种经典的抗氧化剂-乙酰半胱氨酸（NAC），并且发现，U87以及U251细胞应用NAC处理后，其对于PL的杀伤作用明显耐受增强，有统计学意义，见图4。由此上述的结果明确了PL依赖ROS的增加从而介导人胶质瘤细胞的凋亡。

2.5 PL处理后显著降低胶质瘤细胞中PRDX4的活性我们首先通过q-PCR检测了PL处理后两种人胶质瘤细胞系U87、U251以及正常人神经元细胞的ROS相关调节因子中的重要一员，PRDX家族基因表达水平的改变，结果发现，PL处理后与神经元细胞相比，PRDX4基因水平出现了显著性增高，具有统计学意义，见图5。同样的，对PRDX酶活性的检测结果也表明，细胞裂解液中的PRDX的酶活性在PL处理之后明显出现了抑制，具有统计学差异，见图6。上述实验结果说明，PL刺激胶质瘤细胞后，肿瘤细胞中PRDX4的活性受到明显的抑制，结合之前的研究证据，表明PRDX4是PL介导ROS从而导致胶质瘤细胞凋亡的重要媒介。

图1 荜茇酰胺处理后显著性介导胶质瘤细胞凋亡

图2 荜茇酰胺处理后显著性提高胶质瘤细胞中ROS的水平

图3 荜茇酰胺处理后能够选择性增加胶质瘤细胞的凋亡水平

图4 荜茇酰胺对于胶质瘤细胞的杀伤作用依赖于ROS的激活

图5 荜茇酰胺处理后显著降低胶质瘤细胞中PRDX酶的活性

图6 荜茇酰胺处理后显著降低胶质瘤细胞中PRDX4的活性

3 讨论

以往关于PRDX4的研究已经明确的表明，PRDX4在胶质瘤中存在高表达的现象，并且PRDX4敲除之后能够显著增加ROS的水平从而杀伤胶质瘤细胞。但是如何选择性地靶向针对PRDX4进行胶质瘤治疗仍然存在较大争议，特别是PRDX4在多种细胞上都存在广泛的表达。通过本研究，我们发现了一种天然的植物提取物PL，能够特异性的降低胶质瘤细胞中PRDX4的活性，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用[6]。

ROS参与了大量的细胞活动。过量的ROS水平能够引起氧化应激、DNA损伤和基因组的不稳定。因此，ROS水平的高低与肿瘤的发生发展密切相关，同时抗氧化应激反应也是抗肿瘤治疗的潜在靶标。但是，近期的许多研究都表明，许多肿瘤中抗氧化应激蛋白的表达量均高于正常组织。这些在肿瘤组织中高表达的抗氧化应激蛋白减轻了肿瘤中ROS的水平，进而降低了内质网应激，减少了氧化应激对于肿瘤细胞的损伤，使肿瘤细胞更易于生存[7,8]。因此通过增加氧化应激来促进肿瘤细胞的凋亡，将成为未来重要的抗肿瘤治疗方法，而本实验中，PL通过增加ROS的水平从而抑制胶质瘤细胞的增殖水平，是对上述理论的有力支持。

已知PL能够与多种ROS的调节因子相互作用。在本研究中，我们发现胶质瘤细胞中ROS的调节基因的表达水平远高于正常的神经元细胞。但是此前的研究发现，对于CBR1、GSTZ1以及PRDX1等基因的敲除对PL介导的人胶质瘤细胞增殖能力的抑制未见影响。由此说明，PL在胶质瘤细胞中存在其他的作用靶点。本研究中发现PRDX4在PL处理过的胶质瘤细胞中存在明显高表达，为PL作用的靶点提供了新的证据，同时也解释了PL不影响正常神经元细胞的机制，即由于PRDX4在正常细胞中表达量较低，因此PL处理后无法渗入细胞，使其不能诱导凋亡产生[9]。

最后，对于中枢神经系统肿瘤的药物治疗，最为重要的一点即是能够顺利通过血脑屏障。根据相关报道表明，PL能够自由的通过血脑屏障。因此，通过PL抑制PRDX4的活性，进而使胶质瘤细胞中的ROS水平增高，抑制肿瘤生长和增殖，将会成为未来胶质瘤治疗中的一种有效手段。

1 Markovic DS,Vinnakota K,Chirasani S,et al.Gliomas induce and exploit microglial MT1-MMP expression for tumor expansion.Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(30): 12530-12535.

2 Shrivastava S,Kulkarni P,Thummuri D,et al.Piperlongumine,an alkaloid causes inhibition of PI3 K/Akt/mTOR signaling axis to induce caspase-dependent apoptosis in human triple-negative breast cancer cells.Apoptosis,2014,19(7): 1148-1164.

3 Liu Y,Chang Y,Yang C,et al.Biodegradable nanoassemblies of piperlongumine display enhanced anti-angiogenesis and anti-tumor activities.Nanoscale,2014,6(8): 4325-4337.

4 Ryu J,Kim MJ,Kim TO,et al.Piperlongumine as a potential activator of AMP-activated protein kinase in HepG2 cells.Nat Prod Res,2014,28(22): 2040-2043.

5 Liu QR,Liu JM,Chen Y,et al.Piperlongumine inhibits migration of glioblastoma cells via activation of ROS-dependent p38 and JNK signaling pathways.Oxid Med Cell Longev,2014,2014: 653732.

6 Jin HO,Lee YH,Park JA,et al.Piperlongumine induces cell death through ROS-mediated CHOP activation and potentiates TRAIL-induced cell death in breast cancer cells.J Cancer Res Clin Oncol,2014,140(12): 2039-2046.

7 Wu Y,Min X,Zhuang C,et al.Design,synthesis and biological activity of piperlongumine derivatives as selective anticancer agents.Eur J Med Chem,2014,82:545-551.

8 Suzuki-Karasaki Y,Suzuki-Karasaki M,Uchida M,et al.Depolarization controls TRAIL-sensitization and tumor-selective killing of cancer cells: Crosstalk with ROS.Front Oncol,2014,4: 128.

9 Neumann CA,Fang Q.Are peroxiredoxins tumor suppressors? Curr Opin Pharmacol,2007,7(4): 375-380.

Role of piperlongumine in glioma proliferation

Qian ZHANG1,Wenmao XU2

1Ji'nan Evidence Based Medicine Technology Development Center of Shandong,Ji'nan 250022,China;2Institute of Molecular Medicine,Beijing Springer Medical Research Institute,Beijing 100054,China

ObjectivePiperlongumine,a natural plant product,kills multiple cancer types with little effect on normal cells.Piperlongumine raises intracellular levels of reactive oxygen species (ROS),a phenomenon that may underlie the cancer-cell killing.Although these findings suggest that piperlongumine could be useful for treating cancers,the mechanism by which the drug selectively kills cancer cells remains unknown.MethodsWe treated multiple high-grade glioma (HGG) sphere cultures with piperlongumine and assessed its effects on ROS and cell growth levels as well as changes in downstream signaling.We also examined the levels of putative piperlongumine targets and their roles in HGG cell growth.ResultsPiperlongumine treatment increased ROS levels and preferentially killed HGG cells with little effect in normal brain cells.Piperlongumine reportedly increases ROS levels after interactions with several redox regulators.Furthermore,piperlongumine treatment in HGG cells,but not in normal NSCs,increased oxidative inactivation of peroxiredoxin 4 (PRDX4),an ROS-reducing enzyme that is overexpressed in HGGs.Moreover,piperlongumine’s effects was blocked after the inhibition of ROS overexpression in glioma cells.ConclusionOur results reveal that the mechanism by which piperlongumine preferentially kills HGG cells involves PRDX4 inactivation.Therefore,piperlongumine treatment could be considered as a novel therapeutic option for HGG treatment.

Piperlongumine; Glioma; Proliferation