耐喹诺酮类铜绿假单胞菌的耐药分子机制研究

李玲 周飞

耐喹诺酮类铜绿假单胞菌的耐药分子机制研究

李玲 周飞

目的探讨耐喹诺酮类铜绿假单胞菌的耐药分子机制。方法选取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹诺酮类铜绿假单胞菌株，采用PCR技术培养，并将培养收集的菌株点状种植在平板培养基上，培养基是由制备的耐喹诺酮类药物组成。对耐药铜绿假单胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达情况进行检测；将100例培养的铜绿假单胞菌株培养液，每份分为等量两份（每份100例），并将所有的铜绿假单胞菌株接种在含有耐喹诺酮类药物的平板培养基上，其中一份接受常规培养，为对照组，一份放入含有羰基氢氯苯腙（carbonyl hydroch lorophenylhydrazone,CCCP）培养基中进行培养，为观察组，对其耐药性进行分析。结果gyrA的基因表达率为75.00%，parC的基因表达率为74.00%，明显高于gyrB的基因表达率（23.00%）和parE的基因表达率（22.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组中存活菌株数48例（48.00%），明显低于对照组［70例（70.00%）］，差异有统计学意义（P＜0.05） 。结论铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制是gyrA、parC两种基因的表达，其次铜绿假单胞菌的主动泵出系统也是其耐药性的一个重要机制。在临床中应熟悉菌株的耐药机制，选择合理的抗菌药物，可降低临床用药的不良事件的危险性，提高治疗疗效，延长抗菌药物的使用寿命。

反耐喹诺酮类；铜绿假单胞菌；耐药

作者单位：528459 中山，中山市板芙医院

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PAE）是临床上引起感染较为多见的病原菌之一，也是造成医院严重感染和常见的致病条件菌，且感染率在近几十年呈逐渐上升的趋势[1]。随着喹诺酮类广谱抗菌药物在临床的广泛应用，铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物的耐药性逐渐增强，使得控制、治疗铜绿假单胞菌引起的感染变得尤为困难[2]。目前临床公认为铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物的主要耐药机制包括外膜孔蛋白的通透性下降、药物作用的靶位改变、外排泵的主动外排及由介质介导的耐药机制[3]。而由染色体介导引起的对喹诺酮类广谱抗菌药物耐药性只能由亲代垂直传给子代，且具有在不同菌株间不易传播及传播速度慢等特点[4]。但是近几年铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物的耐药上升速度较快，故可能发生由可移动元件如质粒介导的耐药基因的水平转移[5]。为了研究耐喹诺酮类铜绿假单胞菌的耐药分子机制，为临床选择合理用药提供理论基础，本研究对100株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌进行喹诺酮类药物耐药基因检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取我院2013年1月-2015年7月收集的100例耐喹诺酮类铜绿假单胞菌株，其中30株标本从患者的痰液中分离，30株标本从患者的胸水中分离，20株标本从患者的血液中分离，20株标本从患者的尿液中分离。所有的菌株均经VITEK-AMS鉴定，最小抑制浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）均≥4 μg/mL。质控菌株均为铜绿假单胞菌株。

1.2 方法 对收集的100株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌采用PCR技术培养，并将培养收集的菌株点状种植在平板培养基上，培养基由制备的耐喹诺酮类药物组成。对耐药铜绿假单胞菌株中的gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达情况进行检测。

将100例培养的铜绿假单胞菌株培养液，每份分为等量两份（每份100例），并将所有的铜绿假单胞菌株接种在含有耐喹诺酮类药物的平板培养基上，其中一份接受常规培养，为对照组，一份放入含有羰基氢氯苯腙（carbonyl hydrochlorophenylhydrazone,CCCP）培养基中进行培养，为观察组，并将浓度增加至5 mg/L（此浓度对抑制外排泵可起到有效的作用，但对细菌生长无抑制作用），在检测CCCP存在的基础上，观察两组中铜绿假单胞菌株的生长作用。

1.3 观察指标 观察、检测并比较所有培养基中gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达情况、加入CCCP后各菌株的生存情况及gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用t检验，计数资料采用率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达情况比较gyrA的基因表达率为75.00%，parC的基因表达率为74.00%，明显高于gyrB的基因表达率（23.00%）和parE的基因表达率（22.00%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 两组铜绿假单胞菌株生长情况的比较 观察组中存活菌株数48例（48.00%），明显低于对照组［70例（70.00%）］，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 100例培养基中gyrA、gyrB、parC和parE基因的表达比较

表2 两组样本中铜绿假单胞菌株生长情况比较

3 讨论

铜绿假单胞菌是目前医院内引起严重感染的主要病原菌之一，临床资料[6]表明被铜绿假单胞菌感染的患者预后较差。随着社会的发展、生活水平的提高及人们的健康理念的增强，抗生素在临床广泛应用，甚至达到滥用的程度，引起铜绿假单胞菌对多种广谱抗菌药物逐渐产生耐药性，最终导致感染较难控制，对治疗效果造成影响。随着耐药机制研究的不断深入，铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物的主要耐药机制是使靶位点出现改变及外排泵的主动外排和由介质介导的耐药机制[7]。其中靶位点的主要改变包括编码DNA促旋酶的gyrA及gyrB基因和编码DNA拓扑异构酶IV上的parC和parE基因突变。主动泵出系统的组成成分包括连接蛋白、外膜蛋白及内膜蛋白，而外排泵抑制剂CCCCP可有效抑制铜绿假单胞菌的主动泵出系统[8]。

本研究中，通过对100例铜绿假单胞菌株采取常规培养，并对染色体介导的gyrA、gyrB、parC和parE耐药基因进行检测，结果示：gyrA的基因表达率为75.00%，parC的基因表达率为74.00%，明显高于gyrB基因（23.00%）和parE基因（22.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）。编码DNA促旋酶中的gyrA、parC基因存在高表达，这表明铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物耐药性的发生和gyrA、parC的基因突变有较大的关联及临床指导意义。因CCCP可有效抑制主动泵出系统，故在加入CCCP的观察组样本中，耐药菌的生存率明显低于未加入CCCP的对照组，本研究结果显示：观察组中存活菌株数48例（48.00%），明显低于对照组［70例（70.00%）］，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见铜绿假单胞菌的主动泵出系统也是铜绿假单胞菌产生耐药性的一个重要因素。

有文献[9]报道在编码DNA拓扑异构酶IV上的parC和parE基因的表达量和铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物耐药性的相关性研究中，他们之间呈明显相关性，有明显的临床指导意义，故公认为编码DNA拓扑异构酶IV上的parC和parE基因的突变也是引起铜绿假单胞菌对喹诺酮类广谱抗菌药物产生耐药性的主要原因。而喹诺酮类药物作用的包括拓扑异构酶IV和DNA旋转酶，这两个酶均是细菌正常生长所必需的酶，两者中任何一种酶受到破坏或抑制均会对细菌的繁殖生长造成影响，引起细菌死亡[10]。DNA旋转酶属于II型拓扑异构酶，可催化闭环DNA负螺旋化，是ATP酶的能量依赖性酶，其组成成分包括CyrA、CyrB，分别是由gyrA、gyrB基因编码。CyrB可连接ATP参与能量传递，而CyrA可介导DNA发生断裂，其再与DNA连接，是DNA复制过程中所必需的酶。拓扑异构酶IV组成结构包括2个E亚单位和2个C亚单位，所对应的基因编码分别为parE和parC，二者蛋白质在核酸序列及氨基酸序列上均与DNA旋转酶相似。拓扑异构酶IV和DNA旋转酶的变异可引起细菌对喹诺酮类广谱抗菌药物产生耐药性。而这些耐药编码基因gyrA、gyrB、parC和parE在氨基酸的序列及核苷酸顺序上均有很大的相似性。在gyrA和parC基因中存在一个被命名为热点的喹诺酮类耐药决定区（quinolone resislance determining,QRDR）[11]。有文献[12,13]在对铜绿假单胞菌及大肠埃希菌的研究中发现，热点是gyrA内87位的门冬氨酸及83位的丝氨酸及parC内83位门冬氨酸和79位的丝氨酸。正是因为这些氨基酸的改变而引起细菌对抗菌药物产生耐药性及敏感性下降。而细菌的gyrB、parE编码基因较少发生突变[14,15]。

综上所述，铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制是gyrA、parC两种基因的表达，其次铜绿假单胞菌的主动泵出系统，故在临床中应熟悉菌株的耐药机制，选择合理的抗菌药物，可降低临床用药的不良事件的危险性，提高治疗疗效，延长抗菌药物的使用寿命。

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Study on molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa

Ling LI,Fei ZHOU
Banfu Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528459,China

ObjectiveTo study the molecular mechanism of resistance to quinolone-resistantPseudomonas aeruginosa.MethodsFrom January 2013 to July 2015 in Banfu Hospital of Zhongshan City,100 strains of quinolone-resistantPseudomonas aeruginosawere cultured by PCR and the collected strains were planted on plate culture medium.The medium was composed of quinolones.The expressions ofgyrA,gyrB,parCandparEgenes in resistantPseudomonas aeruginosastrains were detected.The resistant strains were analyzed by adding carbonyl hydrochlorophenylhydrazone (CCCP).ResultsThe gene expression rate ofgyrAwas 75.00%; the gene expression rate ofparCwas 74.00%,which was significantly higher than that ofgyrBgene (23.00%) andparEgene(22.00%),with significant differences (P＜0.05).The number of viable strains in the observation group (48.00%)was significantly lower than that in the control group (70.00%),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe main mechanism of quinolones is the expression ofgyrAandparC,and the active pumping system ofPseudomonas aeruginosais also an important mechanism of drug resistance.Therefore,be familiar with the drug resistance mechanism and a reasonable antimicrobial drugs selection could reduce the risk of adverse events and improve the clinical efficacy.

Quinolones;Pseudomonas aeruginosa; Drug resistance