小肽氨基酸组成对体外培养的奶牛乳腺组织乳蛋白合成的影响

周苗苗+崔景香

摘要：为研究不同二肽对奶牛乳腺组织中乳蛋白合成的影响，在体外培养的奶牛乳腺组织培养液中分别添加不同的赖氨酸二肽：赖氨酸-赖氨酸（Lys-Lys）、赖氨酸-组氨酸（Lys-His）、赖氨酸-苯丙氨酸（Lys-Phe）、赖氨酸-亮氨酸（Lys-Leu）和赖氨酸-苏氨酸（Lys-Thr），等量取代培养液中10%游离赖氨酸（赖氨酸总浓度为210 μg/mL）进行培养，试验结束后收集乳腺组织和培养液分别检测基因表达和乳蛋白合成。结果表明，同游离Lys和Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His二肽相比，Lys-Leu和Lys-Phe显著提高了乳腺组织中αs1酪蛋白基因的表达（P<0.05）；5种肽结合Lys均显著提高了小肽转运载体2（PepT2）的mRNA丰度（P<0.05），Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促进PepT2基因的表达（P<0.05）。说明小肽不同的氨基酸组成可影响奶牛小肽的摄取和乳蛋白的合成，同亲水性氨基酸组成的小肽相比，疏水性氨基酸组成的小肽更能促进乳腺αs1酪蛋白基因的表达。

关键词：小肽；氨基酸；赖氨酸二肽；乳蛋白；小肽转运载体2；奶牛乳腺组织；丰度；αs1酪蛋白基因

中图分类号： S823.9+11 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0166-02

收稿日期：2016-04-29

基金项目：山东省潍坊市科技发展计划（编号：2015GX077）。

作者简介：周苗苗（1983—），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事反刍动物泌乳生理研究。E-mail：zhoumm0329@163.com。 乳腺组织能摄取血液循环中的小肽（2～3个氨基酸组成）作为乳蛋白合成的前体物质，小肽在反刍动物乳腺蛋白合成中发挥重要作用[1-2]。很多研究证实，给体外培养的奶牛乳腺上皮细胞培养液中添加适当浓度的必需氨基酸如蛋氨酸（methionine，Met）、赖氨酸（lysine，Lys）、缬氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、苏氨酸（threonine，Thr），小肽均能促进酪蛋白的基因表达和乳蛋白合成[3-9]。目前关于小肽添加量对乳蛋白合成的影响研究较多，而小肽的氨基酸组成对乳蛋白合成影响的研究较少。因此，本试验初步探讨了不同氨基酸组成的含Lys二肽对体外培养的奶牛乳腺组织乳蛋白合成的影响。

1 材料与方法

1.1 奶牛乳腺组织体外培养

取泌乳中期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。将组织块种植于6孔板上，置于二氧化碳培养箱中（37 ℃，5%CO2），待组织贴壁后每孔添加2 mL培养液。培养液成分为基础培养液DMEM（dulbeccos modified eagles medium）-F12（Gibco，美国）添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、5 μg/mL 胰岛素（Sigma，美国）、500 ng/mL催乳素（Sigma，美国）、1 μg/mL氢化可的松（Sigma，美国）以及10%胎牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）。

1.2 试验设计

试验处理培养液中去除胎牛血清、补充几种必需氨基酸[Phe、Met、Lys、Leu、Val、异亮氨酸（isoleucine，Ile）、苏氨酸（threonine，Thr）、组氨酸（histidine，His）]，并按试验设计调整相应氨基酸和小肽的浓度。分别用培养液中Lys总量（210 μg/mL）10%肽结合Lys[Lys-Lys/（LL）、Lys-His/（LH）、Lys-Phe/（LP）、Lys-Leu/（LU）、Lys-Thr/LT]替代等量的Lys。试验处理48 h后，分别收集乳腺组织和培养液用于总RNA提取和总蛋白含量测定。每个处理重复3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol（Invitrogen，美国）提取组织中的总RNA。RNA纯度以紫外吸光法检测（D260 nm/D280 nm>1.80）。抽提的RNA溶解后立即用于第1链cDNA的合成（PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒，TaKaRa）。合成的cDNA贮存于-20 ℃，备用。

1.4 实时荧光定量PCR（real-time PCR）

采用实时荧光定量PCR方法检测mRNA的表达。αs1酪蛋白、小肽转运载体2（oligopeptide transporter 2，PepT2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的实时荧光定量专用引物见表1。PCR反应在96孔板中进行，反应体系为2 μL cDNA模板+18 μL PCR反应液（SYBR Premix Ex TaqTM Real Time PCR试剂盒，TaKaRa）。纯水替代cDNA模版作为阴性对照。反应条件为：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，40个循环；60 ℃ 34 s。ABI7 500实时定量序列检测软件（Applied Biosystems，美国）自动读取循环数（CT）值，GAPDH、αs1酪蛋白和PepT2的扩增效率分别为100.9%、100.1%、101.3%，mRNA相对变化值用公式2-ΔΔCT进行计算。

1.5 DNA总量和培养液中总蛋白质含量测定

用Trizol提取組织中的DNA总量，用紫外吸光度法测定DNA的纯度（D260 nm/D280 nm>1.80）和含量。DNA含量作为“组织数量/细胞数量”的代表，用于校正培养液中的蛋白质

含量。将冷的丙酮沉淀培养液中的蛋白质溶于含1 mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，随后根据Bradford的方法[9]用蛋白质检测试剂盒（博士德，武汉）检测培养液中的总蛋白质含量，并以此代表培养液中的乳蛋白含量。以试验组DNA校正乳蛋白含量[蛋白质质量（mg）同DNA质量（μg）的比值]同对照组DNA校正乳蛋白含量的比值作为最终结果进行比较。endprint

1.6 统计分析

所有数据用Excel软件进行处理，用SAS软件 PROC-GLM 程序进行统计分析。当P<0.05时，认为差异显著。

2 结果与分析

同游离Lys和其他Lys二肽相比，Lys-Leu、Lys-Phe可顯著提高乳腺组织中αs1酪蛋白基因的表达（P<0.05），其中Lys-Phe组αs1酪蛋白mRNA丰度最高（图1-A）。同对照组相比，Lys二肽替代组乳蛋白合成量差异不显著（图1-B）。

5种肽结合Lys的添加均显著提高了PepT2的mRNA丰度（P<0.05，图2）。不同氨基酸残基组成的小肽对PepT2基因表达的影响不同。由图2可见，Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys和Lys-His更能促进PepT2基因的表达（P<0.05）。

3 结论与讨论

小肽的转运是一个复杂的过程，影响因素较多。除肽链长度外，肽的氨基酸残基组成是影响肽吸收的另一个重要因素。一般而言，L型氨基酸组成的小肽要比D型氨基酸组成的小肽更易吸收；中性氨基酸组成的小肽比酸碱性氨基酸组成的小肽更易被动物吸收。在本试验中，同Lys-His、Lys-Thr、Lys-Lys相比，Lys-Leu、Lys-Phe显著增加了乳腺组织中αs1酪蛋白mRNA丰度（P<0.05）。分析小肽的氨基酸组成可以发现，同亲水性和带电荷的氨基酸残基（如Thr、Lys和His）组成的小肽相比，疏水性和体积较大的氨基酸残基（如Phe和Leu）组成的小肽更能促进乳腺中αs1酪蛋白的基因表达和乳蛋白合成。这些结果表明，小肽在促进乳蛋白合成方面的效果受其氨基酸组成的影响。

小肽的吸收主要依赖于小肽转运载体系统。哺乳动物体内主要的小肽转运载体包括PepT1和PepT2。在奶牛乳腺上皮细胞中则仅有PepT2表达[7]。这些肽转运系统不仅可以转运小肽，还可以转运与肽结构类似的药物。与氨基酸（AA）转运机制不同，小肽是逆浓度梯度转运，而且主要依赖H+或Ca2+浓度进行转运。与游离氨基酸（FAA）吸收慢、吸收时耗能高相比，小肽转运系统具有转运速度快、耗能低等特点。小肽与FAA相互独立的吸收机制，有助于减轻由于FAA相互竞争共同吸收位点而产生的吸收抑制。小肽载体对底物具有广泛的适应性，几乎能够转运所有的二肽和三肽[10]。但肽载体对底物构象具有严格的特异性，它对N末端含D型AA的耐受性比C末端为D型的高，而全D型的肽不能作为底物。另外，小肽转运载体对由疏水性和体积较大的氨基酸残基组成的小肽具有高亲和力；而对由亲水性和带电荷的氨基酸残基组成的小肽亲和力较低[11]。本试验中5种肽结合Lys的添加均显著提高了PepT2的mRNA丰度（P<0.05）。PepT2是一种底物亲和力高，但易饱和的转运载体，当底物浓度增加，同时乳腺组织又有摄取小肽的需求时，只能通过增加PepT2的数量来实现。PepT2在奶牛乳腺小肽摄取过程中发挥着关键作用，其蛋白数量同其转运小肽的多少呈正相关关系[6，12]。因此，PepT2的表达增强也说明了乳腺对小肽的摄取增加。此外，不同氨基酸残基组成的赖氨酸小肽对PepT2基因表达的影响不同。Lys-Phe和Lys-Leu比等量的Lys-Thr、Lys-Lys、Lys-His更能促进PepT2基因的表达（P<005）。这一结果同Lys-Phe和Lys-Leu对αs1酪蛋白的基因表达影响结果一致。以上结果说明，小肽不同的氨基酸残基组成可以影响奶牛乳腺上皮细胞小肽的摄取，进而影响乳蛋白的合成。

Lys-Lys、Lys-His、Lys-Leu、Lys-Phe、Lys-Thr对奶牛乳腺组织乳蛋白合成的促进作用依赖于其氨基酸残基的理化性质。同亲水性氨基酸组成的小肽相比，疏水性氨基酸组成的小肽更能促进乳腺αs1酪蛋白基因的表达。

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