螺旋杆菌的检测以及它对小鼠肝脏的影响

赵莉媛 吕奇鹏

(1.青海畜牧兽医职业技术学院,青海湟源 512100;2.西宁市野生动物园,青海西宁 510005)

螺旋杆菌的检测以及它对小鼠肝脏的影响

赵莉媛1吕奇鹏2

(1.青海畜牧兽医职业技术学院,青海湟源 512100;2.西宁市野生动物园,青海西宁 510005)

近年来,螺旋杆菌的感染有上升的趋势,越来越引起临床的重视,实验室采取的鉴定方法尤为重要。目前用的比较多的有微生物分离培养,血清学方法,形态学方法,PCR检查。在过去的十几年中,从小鼠体内能分离出来的螺旋杆菌大致有五种,本文主要涉及肝型和胆囊型螺旋杆菌的PCR鉴定。此外,由于感染螺旋杆菌的小鼠并不一定就患有疾病,通常在体外没有明显的临床症状,研究人员目前还未深究它在体内是否带来影响,因此本文也会讨论螺旋杆菌对小鼠肝脏的影响。

螺旋杆菌;小鼠;鉴定;PCR;影响;肝脏

1 螺旋杆菌鉴定方法简介

由于HP与人类常见病密切相关且在人群中感染率高，因而受到重视，各种检测方法也应运而生，常用的检测方法有微生物学方法，血清学方法，形态学方法和PCR法，但各种检测方法都不尽理想，本文主要介绍PCR法。此方法原理就是基因诊断，利用PCR技术扩增DNA来判断是否带有螺旋杆菌。是目前灵敏度最高的，检测速度最快的，使用最广的检测螺旋杆菌的方法。

2 螺旋杆菌感染对肝脏的影响

螺杆菌感染与肝肠疾病有关，大多数新螺杆菌属成员都是先在动物及禽类等体内分离出来的，动物实验还发现肠道螺杆菌能够进入血液，易位至肝脏引起炎症和肿瘤，这在免疫力低下机体内更为常见。

3 实验部分

3.1 实验步骤（感染螺旋杆菌的小鼠若干只）

3.1.1 病鼠外观及剖检变化：病鼠颈部、背部、大腿外侧被毛脱落，脖颈部皮肤出现不规则溃烂；眼球突出，晶体浑浊，似失明；颌下淋巴结肿大并有针尖大小出血点；胃粘膜出现溃疡，伴有针尖大小出血点；肝脏肿大，有灰白色大小不等坏死灶；脾脏肿大，色素沉着，有灰白色大小不等坏死灶；直肠脱落，肠粘膜出血；肛周溃烂，排便困难，粪便干燥带血成颗粒状。

3.1.2 细菌学培养：分别取病鼠肝脏、直肠、回盲部内容物，加入2号营养肉汤（已加相关抗生素，为选择性培养基），用研磨器匀化后，1000r离心5 min，弃沉淀；上清经0.45 m微孔滤膜过滤后，12000r离心2 min；弃上清，沉淀以100 uL的2号营养肉汤悬浮混匀；移取5Oµl样本接种血平皿。血平皿中添加10µg/ml万古霉素；2.5µg/ml多粘菌素B；5µg/ml甲氧苄氨嘧啶；2µg/ml两性霉素。37℃ 微需氧环境（85%N，10%CO2，5%O2）培养4～6d。

3.1.3 细菌分离：螺旋杆菌的菌落形态很特殊，在培养平皿上菌落如针尖状，折光呈红色；经革兰染色呈阴性，油镜下观察呈月牙形或鸟翼状的独特形态。将分离菌株纯化后做生化分析。

3.1.4 螺旋杆菌DNA提取：经形态观察诊断为螺旋杆菌，刮下其平皿中的菌落，用“小量细菌DNA抽提试剂盒”纯化提取细菌DNA。

3.1.5 PCR扩增及序列测定：引物o508，o509的扩增条件：22µl反应体系中包括2µlDNA模版；10X PCR Buffer II2.2µl；20 mM forward o508 1.1µl；20 mM reverse o509 1.1µl；5 U/ml HOTSTAR Taq 0.12µl；orange dye 3.32µl；2.5 mM dNTP 1.76µl；25mM MgCl2 2.2µl；Q Buffer 2.2ul；H2O 6µl；扩增程序：95℃15 min；94℃ 30 sec；60℃ 30 sec；72℃ 1min；循环35次后72℃2min；扩增产物分析：反应结束后，取5µl扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在紫外灯下观察，使用数字凝胶成像系统记录实验结果。将阳性PCR扩增产物回收纯化后分别送去测序。

3.2 实验结果

3.2.1 细菌学检查：从病鼠的肝、肠样本中均分离到疑似菌株。革兰氏染色结果形状为鸟翼状。在哥伦比亚血琼脂平板上，分离菌株为灰白色、半透明、微凸起、不溶血的小菌落。纯培养物经革兰染色镜检，发现革兰氏阴性细小螺旋杆状细菌，直径为0.2～1.5µm。各项生化反应结果经鉴定完全符合肝螺杆菌的特性。

3.2.2 PCR检测：如图1。测序结果显示：肝螺杆菌鼠源性分离菌株与Genbank中肝螺杆菌相应的基因序列核苷酸同源性高达99%。

图1 PCR扩增螺旋杆菌属16s rRNA与肝螺杆菌16S rRNA基因

3.2.3 病理组织学检查：感染小鼠肝脏的肝细胞肿大，出现大小不等的空泡，部分胞核深染，局部坏死，肝小叶脂肪变性。淋巴细胞散在分布，脾巨噬细胞增多小叶间隔不清晰。

4 结论

本研究选用了适筛检肝螺杆菌的分离培养的方法，建立了肝螺杆菌的多重PCR检测方法，并结合病理学检查方法，对该菌的生物学特性和分子生物学特性进行初步探讨，这为进一步研究肝螺杆菌的致病机理及在我国开展流行病学调查提供了有效的科学依据。

[1]徐叔云主编.药理实验方法学[M.]人民卫生出版社，1982.

[2]施新猷.大鼠各型放射病时心血管功能的变化[J].中华放射医学与防护杂志，1985，5（3）：160.

[3]施新猷.现代实验动物在医学科学研究中的应用[J].第四军医大学学报，1982，3（2）：177.